Co je to polymerázová řetězová reakce?
Polymerázová řetězová reakce (PCR) používá enzymy k hromadné replikaci části řetězce deoxyribonukleové kyseliny (DNA) pro snazší analýzu, jako je hledání hledaných genů. Podobně jako jaderná řetězová reakce je polymerázová řetězová reakce exponenciální proces, který probíhá, dokud jsou k dispozici suroviny pro udržení reakce. Na rozdíl od replikace DNA v přírodním světě může polymerázová řetězová reakce replikovat pouze poměrně malé kousky DNA, s horním stropem asi 2 až 3 kilogramů párů bází (kb). Polymerázová řetězová reakce používá neživé enzymy k dosažení svého replikačního účinku, čímž se odlišuje od jiných přístupů k kopírování, které používají aktivní organismy.
Moderní polymerázová řetězová reakce vyžaduje šest základních složek: DNA segment, který má být kopírován, primery pro vymezení segmentu, Taq polymeráza pro kopírování, DNA nukleotidy sloužící jako výchozí materiál, chemické pufrovací prostředí a stroj zvaný termální cyklista. Termální cyklovač často drží několik zkumavek s více polymerázovými řetězovými reakcemi, z nichž každá drží 15 až 100 mikrolitrů, hodnoty těsně pod krychlovým milimetrem vody. Používá se asi sto nanogramů DNA.
Polymeráza Taq, klíčová složka polymerázové řetězové reakce, je extrahována z hlubinných termálních bakterií Thermus aquaticus . Funguje dobře pro kopírování, ale ne dokonale, což znamená chybu přibližně jednou za každých 8 milionů párů bází. Před Taq polymerázou byly použity jiné polymerázy, ale mnoho z nich se rozpadlo při teplotách nezbytných pro zahájení reakce. Zahřívací cyklus je komplikovaný, ale zahrnuje teploty krátce sahající téměř až k bodu varu, takže životnost polymerázy je nezbytná.
Základní kroky polymerázové řetězové reakce jsou následující. Všechny ingredience jsou smíchány v malé lahvičce, obvykle s objemem 200 mikrogramů. Směs se zahřívá na teplotu blízkou bodu varu, aby se přerušily vodíkové vazby v párové řetězcové DNA, čímž se vytvoří jednotlivé řetězce, které jsou citlivé na kopírování. Tomu se říká denaturace . Čím déle bude kopírovaný řetězec, tím déle bude denaturační proces trvat.
Další krok polymerázové řetězové reakce se nazývá žíhání . Primery, které jsou vyráběny na zakázku, krátké řetězce DNA, jsou navrženy speciálně pro vazbu na místa na začátku a na konci segmentu, který má být kopírován. Pokud jsou primery nesprávně navrženy nebo je teplota v této fázi špatná, primer se váže na DNA náhodně, což má za následek kopii nesprávného segmentu. Většina primerů taje asi ve dvou třetinách cesty k bodu varu a žíhání, proces 1-2 minuty, probíhá v několika stupních pod touto teplotou.
Poslední kroky polymerázové řetězové reakce se nazývají prodlužování a konečné prodlužování . Tady se kouzlo stává. Polymeráza rychle kopíruje segment DNA a během několika minut vytváří miliony a miliony kopií. Cyklus se obvykle skládá ze všech předchozích kroků, opakovaných asi dvacet nebo třicetkrát.
Výsledkem je banda zkopírované DNA. Polymerázové řetězové reakce mají různá použití, včetně testování otcovství, stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti genetické vady nebo virové DNA, klonování genu, zavedení specifických mutací, analýzu DNA zaniklých druhů nebo mrtvých osob, „genetické otisky prstů“ na místo činu a další.