Wie wird der Phosphorylierungsgrad bestimmt?

Der Phosphorylierungsgrad von organischen Molekülen oder Substanzen wird durch zwei Methoden bestimmt: Western Blot und Massenspektrometrie. Phosphorylierung bezieht sich am häufigsten auf die Bindung eines Phosphats an ein Protein. Wenn Phosphate an Proteinen anhaften, werden die natürlichen Prozesse und Funktionen von Proteinenzymen im menschlichen Körper gestört. Die Bestimmung des Phosphorylierungsniveaus ist entscheidend für die Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, von Krebs bis Diabetes.

Western Blot ist eine beliebte Methode zur Bestimmung des Phosphorylierungsgrads einer bestimmten Gruppe von Proteinen. Antikörper wie monoklonale Anti-Phospho-Tyrosin-Antikörper werden typischerweise verwendet, weil sie leicht an Tyrosinreste eines Proteins binden, die durch Phosphorylierung beeinflusst werden. Beim Western-Blotting werden die Proteine ​​zunächst nach ihrer Größe getrennt, wobei ein elektrisches Ladungsverfahren verwendet wird, das als Gelelektrophorese bekannt ist.

Die Proteine ​​werden dann auf eine Membran übertragen, die mit speziellen Antikörpern bedeckt ist, die an Phosphate auf Proteinen binden. Sobald die Proteine ​​übertragen sind, haften die Antikörper an Proteinen mit einem daran gebundenen Phosphat. Der Phosphorylierungsgrad kann dann durch Röntgen der Membran bestimmt werden. Alle betroffenen Proteine ​​geben einen Lichtblitz ab, der es dem Forscher erleichtert, die Phosphorylierungswerte zu messen.

Die Massenspektrometrie ist eine weitere Möglichkeit, den Phosphorylierungsgrad einer Substanz zu messen. Dieser Prozess wandelt die Proteinmoleküle in Ionen um, wodurch sie leichter verfolgt und gemessen werden können. Die Probe wird von einer Hochleistungsionenquelle ionisiert, die die Probe mit Elektronen überschwemmt. Diese Aktion verwandelt die Probe in Kationen, positiv geladene Ionen.

Der Massenanalysator des Massenspektrometers trennt die Ionen nach Masse und Ladungsintensität. Auf diese Weise kann der Forscher das Masse-Ladungs-Verhältnis ermitteln, das für die Ermittlung des Phosphorylierungsgrades der Probe von entscheidender Bedeutung ist. Schließlich misst der Detektor die Ionen, damit die Daten in Diagrammform angezeigt werden können. Das Diagramm zeigt das Masse-Ladungs-Verhältnis der Ionen auf der x-Achse und die relative Intensität der Ionen auf der y-Achse.

Die Phosphorylierungsgrade können auch während der Substratphosphorylierung gemessen werden. Die Substratphosphorylierung ist ein Prozess, bei dem während der Glykolyse Adenosintriphosphat (ATP) entsteht, ein Molekül, das für den Energietransfer zwischen Zellen entscheidend ist. Dieser Prozess findet sowohl in tierischen als auch in pflanzlichen Zellen statt.

In Pflanzenzellen werden ATP-Moleküle unter Verwendung von Sonnenenergie erzeugt. Diese Energie spornt die Phosphorylierung in den Chloroplasten der Pflanze an, dem Ort der Photosynthese der Pflanzen. Der Phosphorylierungsgrad korreliert mit der Menge an Phosphat, die zur Erzeugung zusätzlicher ATP-Moleküle benötigt wird.