Jak je stanovena úroveň fosforylace?

Úroveň fosforylace organických molekul nebo látek je stanovena dvěma metodami: westernovým přenosem a hmotnostní spektrometrií. Fosforylace nejčastěji označuje připojení fosfátu k proteinu. Když se fosfáty váží na protiens, narušují se přirozené procesy a funkce proteinových enzymů v lidském těle. Stanovení hladiny fosforylace je rozhodující pro léčení široké škály chorob, od rakoviny po cukrovku.

Western blotting je populární metoda používaná ke stanovení úrovně fosforylace konkrétní sady proteinů. Protilátky, jako jsou anti-fosfo-tyrosinové monoklonální protilátky, se obvykle používají, protože se snadno vážou na tyrosinové zbytky proteinu, které jsou ovlivněny fosforylací. Při westernovém přenosu se proteiny nejprve separují podle velikosti pomocí metody elektrického náboje známého jako gelová elektroforéza.

Proteiny jsou poté přeneseny na membránu, která byla pokryta speciálními protilátkami, které se vážou na fosfáty na proteinech. Jakmile jsou proteiny přeneseny, protilátky se přilepí na všechny proteiny s připojeným fosfátem. Hladina fosforylace může být potom stanovena rentgenem membrány. Jakékoli ovlivněné proteiny uvolní záblesk světla, což usnadní výzkumníkovi měření hladiny fosforylace.

Hmotnostní spektrometrie je další způsob měření hladiny fosforylace látky. Tento proces přeměňuje proteinové molekuly na ionty, což usnadňuje jejich sledování a měření. Vzorek je ionizován vysoce výkonným iontovým zdrojem, který vzorek inunduje elektrony. Tato akce změní vzorek na kationty, kladně nabité ionty.

Hmotnostní analyzátor hmotnostního spektrometru odděluje ionty svou hmotností a intenzitou náboje. To umožňuje výzkumníkovi objevit poměr hmotnosti k náboji, což je rozhodující při objevování úrovně fosforylace vzorku. Nakonec detektor měří ionty tak, aby mohla být data zobrazena ve formě grafu. Graf ukazuje poměr hmotnosti k náboji iontů na ose x a relativní intenzitu iontů na ose y.

Hladiny fosforylace lze také měřit během fosforylace substrátu. Fosforylace substrátu je proces, který během glykolýzy vytváří adenosintrifosfát (ATP), molekulu kritickou pro přenos energie mezi buňkami. K tomuto procesu dochází jak v živočišných buňkách, tak v rostlinných buňkách.

V rostlinných buňkách jsou molekuly ATP vytvářeny pomocí energie ze slunce. Tato energie urychluje fosforylaci v chloroplastech rostliny, v místě fotosyntézy rostliny. Hladina fosforylace koreluje s množstvím fosfátu potřebného k vytvoření dalších molekul ATP.