Jak określa się poziom fosforylacji?

Poziom fosforylacji cząsteczek lub substancji organicznych określa się dwiema metodami: western blotting i spektrometrią mas. Fosforylacja najczęściej odnosi się do przyłączenia fosforanu do białka. Kiedy fosforany przyłączają się do protiens, naturalne procesy i funkcje enzymów białkowych w ludzkim ciele są zaburzone. Określenie poziomu fosforylacji ma kluczowe znaczenie w leczeniu wielu chorób, od raka po cukrzycę.

Western blotting jest popularną metodą stosowaną do określania poziomu fosforylacji określonego zestawu białek. Przeciwciała, takie jak monoklonalne przeciwciała przeciw fosfotyrozynie, są zwykle stosowane, ponieważ łatwo wiążą się z resztami tyrozyny białka, na które wpływa fosforylacja. W western blotting białka są najpierw rozdzielane według wielkości przy użyciu metody ładunku elektrycznego znanej jako elektroforeza żelowa.

Białka są następnie przenoszone na błonę pokrytą specjalnymi przeciwciałami, które wiążą się z fosforanami na białkach. Po przeniesieniu białek przeciwciała przylegają do dowolnych białek z dołączonym fosforanem. Poziom fosforylacji można następnie określić za pomocą prześwietlenia rentgenowskiego membrany. Wszelkie dotknięte białka wydzielają błysk światła, co ułatwia badaczowi pomiar poziomów fosforylacji.

Spektrometria mas to kolejny sposób pomiaru poziomu fosforylacji substancji. Proces ten przekształca cząsteczki białka w jony, co ułatwia ich śledzenie i pomiar. Próbka jest jonizowana przez źródło jonów o dużej mocy, które zalewa próbkę elektronami. To działanie zamienia próbkę w kationy, dodatnio naładowane jony.

Analizator masy spektrometru mas oddziela jony według ich masy i intensywności ładunku. Pozwala to badaczowi odkryć stosunek masy do ładunku, który ma kluczowe znaczenie w wykrywaniu poziomu fosforylacji próbki. Na koniec detektor mierzy jony w kolejności, dzięki czemu dane mogą być wyświetlane w formie wykresu. Wykres pokazuje stosunek masy do ładunku jonów na osi x oraz względne natężenie jonów na osi y.

Poziomy fosforylacji można również zmierzyć podczas fosforylacji substratu. Fosforylacja substratu jest procesem, który tworzy adenozynotrifosforan (ATP), cząsteczkę kluczową dla transferu energii między komórkami podczas glikolizy. Proces ten zachodzi zarówno w komórkach zwierzęcych, jak i komórkach roślinnych.

W komórkach roślinnych cząsteczki ATP powstają przy użyciu energii słonecznej. Energia ta pobudza fosforylację w chloroplastach rośliny, miejscu fotosyntezy rośliny. Poziom fosforylacji koreluje z ilością fosforanu potrzebną do wytworzenia dodatkowych cząsteczek ATP.