Como é determinado o nível de fosforilação?

O nível de fosforilação de moléculas ou substâncias orgânicas é determinado por dois métodos: western blotting e espectrometria de massa. A fosforilação geralmente se refere à ligação de um fosfato à proteína. Quando os fosfatos se ligam aos protiens, os processos e funções naturais das enzimas proteicas no corpo humano são perturbados. A determinação do nível de fosforilação é crucial para o tratamento de uma ampla gama de doenças, do câncer ao diabetes.

O Western blotting é um método popular usado para determinar o nível de fosforilação de um conjunto específico de proteínas. Anticorpos como anticorpos monoclonais anti-fosfo-tirosina são normalmente usados ​​porque se ligam facilmente aos resíduos de tirosina de uma proteína, que são afetados pela fosforilação. No western blotting, as proteínas são primeiro separadas por tamanho usando um método de carga elétrica conhecido como eletroforese em gel.

As proteínas são então transferidas para uma membrana que foi coberta com anticorpos especiais que se ligam aos fosfatos nas proteínas. Depois que as proteínas são transferidas, os anticorpos aderem a qualquer proteína com um fosfato conectado. O nível de fosforilação pode então ser determinado por um raio-x da membrana. Quaisquer proteínas afetadas emitem um flash de luz, facilitando para o pesquisador medir os níveis de fosforilação.

A espectrometria de massa é outra maneira de medir o nível de fosforilação de uma substância. Esse processo converte as moléculas de proteína em íons, o que as torna mais fáceis de rastrear e medir. A amostra é ionizada por uma fonte de íons de alta potência que inunda a amostra com elétrons. Essa ação transforma a amostra em cátions, íons carregados positivamente.

O analisador de massa do espectrômetro de massa separa os íons por sua massa e intensidade de carga. Isso permite que o pesquisador descubra a razão massa / carga, o que é essencial para descobrir o nível de fosforilação da amostra. Finalmente, o detector mede os íons em ordem para que os dados possam ser exibidos em forma de gráfico. O gráfico mostra a razão massa / carga dos íons no eixo x e a intensidade relativa dos íons no eixo y.

Os níveis de fosforilação também podem ser medidos durante a fosforilação do substrato. A fosforilação do substrato é um processo que cria adenosina trifosfato (ATP), uma molécula crítica para a transferência de energia entre as células, durante a glicólise. Esse processo ocorre nas células animais e nas células vegetais.

Nas células vegetais, as moléculas de ATP são criadas usando energia do sol. Essa energia estimula a fosforilação nos cloroplastos da planta, o local da fotossíntese da planta. O nível de fosforilação se correlaciona com a quantidade de fosfato necessária para criar moléculas adicionais de ATP.