Hvordan bestemmes fosforyleringsnivå?

Fosforyleringsnivået for organiske molekyler eller stoffer bestemmes ved to metoder: western blotting og massespektrometri. Fosforylering refererer ofte til tilknytning av et fosfat til protein. Når fosfater knytter seg til protiens, forstyrres de naturlige prosessene og funksjonene til proteinenzymer i menneskekroppen. Å bestemme fosforyleringsnivået er avgjørende for å behandle et bredt spekter av sykdommer, fra kreft til diabetes.

Western blotting er en populær metode som brukes til å bestemme fosforyleringsnivået til et bestemt sett med proteiner. Antistoffer som anti-fosfo-tyrosin monoklonale antistoffer brukes vanligvis fordi de lett binder seg til et proteins tyrosinrester, som er påvirket av fosforylering. I western blotting blir proteinerne først separert etter størrelse ved bruk av en elektrisk ladningsmetode kjent som gelelektroforese.

Proteinene overføres deretter til en membran som har blitt dekket med spesielle antistoffer som binder seg til fosfater på proteiner. Når proteinene er overført, vil antistoffene feste seg til proteiner med tilknyttet fosfat. Fosforyleringsnivået kan deretter bestemmes av en røntgen av membranen. Eventuelle berørte proteiner vil gi fra seg et lysglimt, noe som gjør det lettere for forskeren å måle fosforyleringsnivåer.

Massespektrometri er en annen måte å måle fosforyleringsnivået til et stoff. Denne prosessen konverterer proteinmolekylene til ioner, noe som gjør dem lettere å spore og måle. Prøven blir ionisert av en høydrevet ionekilde som oversvømmer prøven med elektroner. Denne handlingen gjør prøven til kationer, positivt ladede ioner.

Masseanalysatoren til massespektrometeret skiller ionene etter deres masse og ladningsintensitet. Dette gjør det mulig for forskeren å oppdage forholdet mellom masse og ladning, som er avgjørende for å oppdage fosforyleringsnivået til prøven. Til slutt måler detektoren ionene i rekkefølge slik at dataene kan vises i kartform. Diagrammet viser forholdet mellom masse og ladning for ionene på x-aksen, og den relative intensiteten til ionene på y-aksen.

Fosforyleringsnivåer kan også måles under substratfosforylering. Substratfosforylering er en prosess som skaper adenosintrifosfat (ATP), et molekyl som er kritisk for energioverføring blant celler, under glykolyse. Denne prosessen skjer i både dyreceller og planteceller.

I planteceller lages ATP-molekyler ved å bruke energi fra solen. Denne energien ansporer fosforylering i plantens kloroplaster, stedet for plantens fotosyntese. Nivået av fosforylering korrelerer med mengden fosfat som trengs for å lage ytterligere ATP-molekyler.