Hoe wordt het fosforylatieniveau bepaald?

Het fosforylatieniveau van organische moleculen of stoffen wordt bepaald door twee methoden: western blotting en massaspectrometrie. Fosforylering verwijst meestal naar de hechting van een fosfaat aan eiwit. Wanneer fosfaten zich hechten aan protiens, worden de natuurlijke processen en functies van eiwitenzymen in het menselijk lichaam verstoord. Het bepalen van het fosforylatieniveau is cruciaal voor de behandeling van een breed scala aan ziekten, van kanker tot diabetes.

Western-blotting is een populaire methode die wordt gebruikt om het fosforylatieniveau van een bepaalde set eiwitten te bepalen. Antilichamen zoals anti-fosfo-tyrosine monoklonale antilichamen worden typisch gebruikt omdat ze gemakkelijk binden aan de tyrosineresten van een eiwit, die worden beïnvloed door fosforylering. Bij western blotting worden de eiwitten eerst op grootte gescheiden met behulp van een elektrische ladingsmethode die bekend staat als gelelektroforese.

De eiwitten worden vervolgens overgebracht naar een membraan dat is bedekt met speciale antilichamen die binden aan fosfaten op eiwitten. Nadat de eiwitten zijn overgebracht, blijven de antilichamen aan alle eiwitten met een aangehecht fosfaat plakken. Het fosforylatieniveau kan vervolgens worden bepaald met een röntgenfoto van het membraan. Alle aangetaste eiwitten zullen een lichtflits afgeven, waardoor het voor de onderzoeker gemakkelijker wordt om fosforylatieniveaus te meten.

Massaspectrometrie is een andere manier om het fosforylatieniveau van een stof te meten. Dit proces zet de eiwitmoleculen om in ionen, waardoor ze gemakkelijker te volgen en te meten zijn. Het monster wordt geïoniseerd door een krachtige ionenbron die het monster overspoelt met elektronen. Deze actie verandert het monster in kationen, positief geladen ionen.

De massa-analysator van de massaspectrometer scheidt de ionen door hun massa en intensiteit van lading. Hierdoor kan de onderzoeker de massa-ladingverhouding ontdekken, wat van cruciaal belang is bij het ontdekken van het fosforylatieniveau van het monster. Ten slotte meet de detector de ionen zodat de gegevens in kaartvorm kunnen worden weergegeven. De grafiek toont de massa-ladingverhouding van de ionen op de x-as en de relatieve intensiteit van de ionen op de y-as.

Fosforylatie niveaus kunnen ook worden gemeten tijdens substraat fosforylering. Substraatfosforylering is een proces dat tijdens glycolyse adenosinetrifosfaat (ATP) creëert, een molecuul dat cruciaal is voor energieoverdracht tussen cellen. Dit proces vindt plaats in zowel dierlijke cellen als plantencellen.

In plantencellen worden ATP-moleculen gemaakt met behulp van energie van de zon. Deze energie stimuleert fosforylering in de chloroplasten van de plant, de plaats van plantfotosynthese. Het fosforylatieniveau hangt samen met de hoeveelheid fosfaat die nodig is om extra ATP-moleculen te maken.