Hvordan bestemmes fosforyleringsniveau?

Fosforyleringsniveauet for organiske molekyler eller stoffer bestemmes ved to metoder: western blotting og massespektrometri. Fosforylering refererer ofte til binding af et fosfat til protein. Når fosfater hænger sammen med protiens, forstyrres de naturlige processer og funktioner af protein-enzymer i den menneskelige krop. Bestemmelse af fosforyleringsniveauet er afgørende for behandling af en lang række sygdomme, fra kræft til diabetes.

Western blotting er en populær metode, der anvendes til at bestemme phosphoryleringsniveauet for et bestemt sæt proteiner. Antistoffer, såsom anti-phospho-tyrosin monoklonale antistoffer, anvendes typisk, fordi de let binder til et proteins tyrosinrester, som er påvirket af phosphorylering. Ved western blotting separeres proteinerne først efter størrelse ved hjælp af en elektrisk ladningsmetode kendt som gelelektroforese.

Proteinerne overføres derefter til en membran, der er blevet dækket med specielle antistoffer, der binder til phosphater på proteiner. Når proteinerne er overført, klæber antistofferne på eventuelle proteiner med et vedhæftet phosphat. Fosforyleringsniveauet kan derefter bestemmes ved hjælp af en røntgenstråle af membranen. Eventuelle påvirkede proteiner afgiver et lysglimt, hvilket gør det lettere for forskeren at måle fosforyleringsniveauer.

Massespektrometri er en anden måde at måle et substans fosforyleringsniveau på. Denne proces omdanner proteinmolekylerne til ioner, hvilket gør dem lettere at spore og måle. Prøven ioniseres af en højdrevet ionkilde, der oversvømmer prøven med elektroner. Denne handling forvandler prøven til kationer, positivt ladede ioner.

Massespektrometret adskiller ionerne ved deres masse og ladningsintensitet. Dette gør det muligt for forskeren at opdage forholdet mellem masse og ladning, som er kritisk for at opdage phosphoryleringsniveauet for prøven. Endelig måler detektoren ioner i rækkefølge, så dataene kan vises i kortform. Diagrammet viser masse-til-opladningsforholdet for ionerne på x-aksen og den relative intensitet af ionerne på y-aksen.

Phosphoryleringsniveauer kan også måles under substratphosphorylering. Substratphosphorylering er en proces, der skaber adenosintrifosfat (ATP), et molekyle, der er kritisk for energioverførsel mellem celler, under glykolyse. Denne proces forekommer i både dyreceller og planteceller.

I planteceller dannes ATP-molekyler ved at bruge energi fra solen. Denne energi fremkalder fosforylering i plantens chloroplaster, stedet for plantens fotosyntese. Niveauet af phosphorylering korrelerer med den mængde fosfat, der er nødvendigt for at skabe yderligere ATP-molekyler.