¿Cuál es el punto isoeléctrico?
Las proteínas
están construidas con cadenas de aminoácidos, cada una de las cuales tiene diferentes valores de pH. El pH general de la proteína está compuesto por la mezcla de los valores de pH de los aminoácidos individuales, ya que forman iones en la solución particular en la que se disuelven. El punto isoeléctrico (PI) de una proteína es el pH al que esa proteína no tiene carga neta. Esta propiedad se puede explotar para separar la proteína con la PI conocida de otras proteínas en una mezcla heterogénea.
Los aminoácidos tienen un grupo terminal amino que es básico, que tiene un pH alto. El otro extremo del aminoácido es el terminal carboxilo que es ácido, con un pH bajo. A diferentes valores de pH, los aminoácidos en las proteínas variarán en sus cargas. Las proteínas debajo de su punto isoeléctrico tienen una carga positiva. En contraste, los que están por encima de este punto tienen una carga negativa.
para explotar el conocimiento del punto isoeléctrico para PPurificación de roteína, una mezcla de proteínas se somete a un campo eléctrico. Esto se hace comúnmente en geles de agarosa o poliacrilamida, y se conoce como enfoque isoeléctrico. Una técnica más antigua es realizar el procedimiento a mayor escala en una columna de vidrio utilizando una solución de sacarosa con electrodos en cada extremo. Se agregan compuestos llamados anfolitos que causan la formación de un gradiente de pH consistente. Cuando el gel o columna se somete a la corriente eléctrica, las proteínas migran hasta que alcanzan su punto isoeléctrico y luego permanecen estacionarios.
Las proteínas en los geles generalmente se hacen visibles por un colorante que se une a las proteínas. A veces, si se estudian enzimas, se puede usar un sustrato que proporciona una reacción coloreada. Por lo general, se utilizan estándares que tienen proteínas de puntos isoeléctricos conocidos.
Una vez que uno sabe dónde se encuentra la proteína deseada, una técnica común es cortar la proteína aislada del gel. La proteína se puede purificar y secuenciar. Una vez que la secuenciaSe conoce a CE, se puede usar para diseñar cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y usarse para clonar el gen para la proteína si hay material de ácido nucleico adecuado.
El enfoque isoeléctrico también es una forma común de analizar proteínas estrechamente relacionadas para ver cuán diferentes son entre sí. Una complicación puede ser que las proteínas pueden tener azúcares unidos a ellas. Esto se llama glucosilación y puede afectar la PI de la proteína. Puede parecer que hay múltiples proteínas con diferentes puntos isoeléctricos, cuando en realidad solo hay una proteína que se ha glucosilada diferencialmente. Las proteínas purificadas por métodos estándar como la cromatografía a veces se analizan por el enfoque isoeléctrico para garantizar su pureza.