¿Qué es el punto isoeléctrico?
Las proteínas están formadas por cadenas de aminoácidos, cada una de las cuales tiene diferentes valores de pH. El pH general de la proteína se compone de la mezcla de los valores de pH de los aminoácidos individuales a medida que forman iones en la solución particular en la que se disuelven. El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH al que esa proteína no tiene carga neta. Esta propiedad puede explotarse para separar la proteína con el pI conocido de otras proteínas en una mezcla heterogénea.
Los aminoácidos tienen un grupo amino terminal que es básico y tiene un pH alto. El otro extremo del aminoácido es el terminal carboxilo que es ácido, con un pH bajo. A diferentes valores de pH, los aminoácidos en las proteínas variarán en sus cargas. Las proteínas por debajo de su punto isoeléctrico tienen una carga positiva. En contraste, los que están por encima de este punto tienen una carga negativa.
Para explotar el conocimiento del punto isoeléctrico para la purificación de proteínas, una mezcla de proteínas se somete a un campo eléctrico. Esto se hace comúnmente en geles de agarosa o poliacrilamida, y se conoce como enfoque isoeléctrico. Una técnica más antigua es realizar el procedimiento a mayor escala en una columna de vidrio utilizando una solución de sacarosa con electrodos en cada extremo. Se añaden compuestos llamados anfolitos que causan la formación de un gradiente de pH constante. Cuando el gel o la columna se somete a la corriente eléctrica, las proteínas migran hasta que alcanzan su punto isoeléctrico y luego permanecen estacionarias.
Las proteínas en geles generalmente se hacen visibles por un tinte que une proteínas. A veces, si se están estudiando enzimas, se puede usar un sustrato que da una reacción coloreada. Por lo general, se usan estándares que tienen proteínas de puntos isoeléctricos conocidos.
Una vez que uno sabe dónde se encuentra la proteína deseada, una técnica común es cortar la proteína aislada del gel. La proteína se puede purificar y secuenciar. Una vez que se conoce la secuencia, puede usarse para diseñar cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (pcr) y usarse para clonar el gen para la proteína si está disponible un material de ácido nucleico adecuado.
El enfoque isoeléctrico también es una forma común de analizar proteínas estrechamente relacionadas para ver qué tan diferentes son unas de otras. Una complicación puede ser que las proteínas pueden tener azúcares unidos a ellas. Esto se llama glicosilación y puede afectar el pI de la proteína. Puede parecer que hay múltiples proteínas con diferentes puntos isoeléctricos, cuando en realidad solo hay una proteína que ha sido glucosilada diferencialmente. Las proteínas purificadas por métodos estándar como la cromatografía a veces se analizan por enfoque isoeléctrico para garantizar su pureza.