Jaký je isoelektrický bod?

Proteiny

jsou stavěny z řetězců aminokyselin, z nichž každá má různé hodnoty pH. Celkový pH proteinu je složen ze směsi hodnot pH jednotlivých aminokyselin, protože vytvářejí ionty v konkrétním roztoku, ve kterém jsou rozpuštěny. Isoelektrický bod (PI) proteinu je pH, při kterém tento protein nemá čistý náboj. Tuto vlastnost lze využít k oddělení proteinu se známým PI od jiných proteinů v heterogenní směsi. Aminokyseliny

mají amino terminálovou skupinu, která je základní a má vysoké pH. Druhým koncem aminokyseliny je karboxylový terminál, který je kyselý, s nízkým pH. Při různých hodnotách pH se aminokyseliny na proteinech budou lišit v jejich náboji. Proteiny pod jejich isoelektrickým bodem mají kladný náboj. Naproti tomu nad tímto bodem mají záporný náboj.

Chcete -li využít znalosti isoelektrického bodu pro PČištění roteinu, směs proteinů je podrobena elektrickému poli. To se běžně provádí v agarózových nebo polyakryladových gelech a je známé jako isoelektrické zaostření. Starší technikou je provádět postup ve větším měřítku ve skleněném sloupci pomocí roztoku sacharózy s elektrodami na každém konci. Přidávají se sloučeniny nazývané amfolyty, které způsobují tvorbu konzistentního gradientu pH. Když je gel nebo sloupec vystaven elektrickému proudu, proteiny migrují, dokud nedosáhnou svého izoelektrického bodu, a poté zůstanou stacionární.

proteiny na gelech jsou obvykle viditelné barvivem, které váže proteiny. Někdy, pokud jsou studovány enzymy, lze použít substrát, který dává barevnou reakci. Obvykle se používají standardy, které mají proteiny známých izoelektrických bodů.

Jakmile jeden ví, kde je požadovaný protein umístěn, běžnou technikou je vystřihnout izolovaný protein z gelu. Protein pak může být purifikován a sekvenován. Jakmile je sekvenceCE je známo, může být použit k návrhu primerů pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a použit k klonování genu pro protein, pokud je k dispozici vhodný materiál nukleové kyseliny.

Isoelektrické zaostření je také běžným způsobem, jak analyzovat úzce související proteiny, aby se viděly, jak se od sebe liší. Jednou komplikací může být to, že proteiny mohou mít na ně vázány cukry. Tomu se nazývá glykosylace a může ovlivnit PI proteinu. Může to vypadat, že existuje více proteinů s různými isoelektrickými body, kdy ve skutečnosti existuje pouze jeden protein, který byl odlišně glykosylován. Proteiny purifikované standardními metodami, jako je chromatografie, jsou někdy analyzovány izoelektrickým zaostřením, aby se zajistila jejich čistota.