Co je to izoelektrický bod?
Proteiny jsou tvořeny řetězci aminokyselin, z nichž každá má různé hodnoty pH. Celkové pH proteinu se skládá ze směsi hodnot pH jednotlivých aminokyselin, když vytvářejí ionty v konkrétním roztoku, ve kterém jsou rozpuštěny. Izoelektrický bod (pi) proteinu je pH, při kterém tento protein nemá žádný čistý náboj. Tuto vlastnost lze využít k oddělení proteinu se známým pi od ostatních proteinů v heterogenní směsi.
Aminokyseliny mají amino-koncovou skupinu, která je bazická a má vysoké pH. Druhým koncem aminokyseliny je karboxylový terminál, který je kyselý, s nízkým pH. Při různých hodnotách pH se aminokyseliny v proteinech budou lišit v jejich nábojích. Proteiny pod jejich isoelektrickým bodem mají kladný náboj. Naproti tomu ti, kteří jsou nad tímto bodem, mají záporný náboj.
Pro využití znalostí o izoelektrickém bodu pro purifikaci proteinu je směs proteinů vystavena elektrickému poli. Toto se běžně provádí v agarózových nebo polyakrylamidových gelech a je známé jako izoelektrické fokusace. Starší technikou je provádění postupu ve větším měřítku ve skleněné koloně za použití roztoku sacharózy s elektrodami na každém konci. Přidají se sloučeniny zvané amfolyty, které způsobují vytvoření konzistentního gradientu pH. Když je gel nebo kolona vystavena elektrickému proudu, proteiny migrují, dokud nedosáhnou svého izoelektrického bodu, a poté zůstávají nehybné.
Proteiny na gelech jsou obvykle zviditelněny barvivem, které váže proteiny. Někdy, pokud se studují enzymy, lze použít substrát, který dává barevnou reakci. Obvykle se používají standardy, které obsahují proteiny známých izoelektrických bodů.
Jakmile člověk ví, kde je požadovaný protein lokalizován, je běžnou technikou vyříznout izolovaný protein z gelu. Protein pak může být purifikován a sekvenován. Jakmile je sekvence známa, může být použita pro návrh primerů pro polymerázovou řetězovou reakci (pcr) a použita pro klonování genu pro protein, pokud je k dispozici vhodný materiál nukleové kyseliny.
Izoelektrická fokusace je také běžný způsob, jak analyzovat úzce příbuzné proteiny a zjistit, jak se vzájemně liší. Jednou komplikací může být to, že na proteiny mohou být vázány cukry. Toto se nazývá glykosylace a může ovlivnit pl proteinu. Může to vypadat, že existuje více proteinů s různými izoelektrickými body, i když ve skutečnosti existuje pouze jeden protein, který byl odlišně glykosylován. Proteiny purifikované standardními metodami, jako je chromatografie, se někdy analyzují izoelektrickým fokusem, aby se zajistila jejich čistota.