Vad är den isoelektriska punkten?
Proteiner är byggda av kedjor av aminosyror, som var och en har olika pH-värden. Det totala pH-värdet för proteinet består av blandningen av pH-värdena för de enskilda aminosyrorna när de bildar joner i den speciella lösningen i vilken de är upplösta. Den isoelektriska punkten (pl) för ett protein är pH vid vilket proteinet inte har någon nettoladdning. Denna egenskap kan utnyttjas för att separera proteinet med det kända pl från andra proteiner i en heterogen blandning.
Aminosyror har en aminoterminal grupp som är basisk och har ett högt pH. Den andra änden av aminosyran är karboxylterminalen som är sur, med ett lågt pH. Vid olika pH-värden kommer aminosyrorna på proteinerna att variera i deras laddningar. Proteiner under deras isoelektriska punkt har en positiv laddning. Däremot har de ovanför denna punkt en negativ laddning.
För att utnyttja kunskap om den isoelektriska punkten för proteinrening utsätts en blandning av proteiner för ett elektriskt fält. Detta görs vanligtvis i agaros- eller polyakrylamidgeler och kallas isoelektrisk fokusering. En äldre teknik är att utföra proceduren i större skala i en glaskolonn med en lösning av sackaros med elektroder i varje ände. Föreningar som kallas amfololyter tillsätts som orsakar bildandet av en konstant pH-gradient. När gelén eller kolonnen utsätts för den elektriska strömmen, migrerar proteinerna tills de når sin isoelektriska punkt och förblir sedan stationära.
Proteiner på geler synliggörs vanligtvis av ett färgämne som binder proteiner. Ibland, om enzymer studeras, kan ett substrat användas som ger en färgad reaktion. Vanligtvis används standarder som har proteiner med kända isoelektriska punkter.
När man väl vet var det önskade proteinet är, är en vanlig teknik att skära ut det isolerade proteinet från gelén. Proteinet kan sedan renas och sekvenseras. När väl sekvensen är känd kan den användas för att designa primers för polymeraskedjereaktionen (pcr) och användas för att klona genen för proteinet om lämpligt nukleinsyramaterial är tillgängligt.
Isoelektrisk fokusering är också ett vanligt sätt att analysera närbesläktade proteiner för att se hur olika de är från varandra. En komplikation kan vara att proteiner kan ha socker bundna till dem. Detta kallas glykosylering och kan påverka proteinets PI. Det kan se ut som det finns flera proteiner med olika isoelektriska punkter, när det faktiskt bara finns ett protein som har differentiellt glykosylerat. Proteiner som renas med standardmetoder såsom kromatografi analyseras ibland genom isoelektrisk fokusering för att säkerställa deras renhet.