Hvad er det isoelektriske punkt?

Proteiner er bygget af kæder af aminosyrer, som hver har forskellige pH-værdier. Proteinets samlede pH-værdi er sammensat af blandingen af ​​pH-værdierne for de individuelle aminosyrer, når de danner ioner i den bestemte opløsning, hvori de opløses. Det isoelektriske punkt (pl) for et protein er den pH, ved hvilken proteinet ikke har nogen nettoladning. Denne egenskab kan udnyttes til at adskille proteinet med det kendte pl fra andre proteiner i en heterogen blanding.

Aminosyrer har en aminoterminal gruppe, der er basisk, og som har en høj pH. Den anden ende af aminosyren er den carboxylterminale, der er sur, med en lav pH. Ved forskellige pH-værdier vil aminosyrerne på proteinerne variere i deres ladninger. Proteiner under deres isoelektriske punkt har en positiv ladning. I modsætning hertil har dem over dette punkt en negativ ladning.

For at udnytte viden om det isoelektriske punkt til proteinoprensning underkastes en blanding af proteiner et elektrisk felt. Dette gøres ofte i agarose- eller polyacrylamidgeler og er kendt som isoelektrisk fokusering. En ældre teknik er at udføre proceduren i større skala i en glaskolonne ved hjælp af en opløsning af saccharose med elektroder i hver ende. Forbindelser kaldet ampholytes tilsættes, der forårsager dannelse af en konsistent pH-gradient. Når gelen eller søjlen udsættes for den elektriske strøm, migrerer proteinerne, indtil de når deres isoelektriske punkt og forbliver derefter stationære.

Proteiner på geler synliggøres generelt af et farvestof, der binder proteiner. Nogle gange, hvis enzymer undersøges, kan der anvendes et substrat, der giver en farvet reaktion. Normalt anvendes standarder, der har proteiner med kendte isoelektriske punkter.

Når man først ved, hvor det ønskede protein er placeret, er en almindelig teknik at skære det isolerede protein ud af gelen. Proteinet kan derefter oprenses og sekventeres. Når sekvensen er kendt, kan den bruges til at designe primere til polymerasekædereaktionen (pcr) og bruges til at klone genet for proteinet, hvis der er passende nucleinsyremateriale tilgængeligt.

Isoelektrisk fokusering er også en almindelig måde at analysere tæt beslægtede proteiner for at se, hvor forskellige de er fra hinanden. En komplikation kan være, at proteiner kan have sukker bundet til dem. Dette kaldes glycosylering og kan påvirke proteinets PI. Det kan se ud som om der er flere proteiner med forskellige isoelektriske punkter, når der faktisk kun er et protein, der er blevet differentielt glycosyleret. Proteiner oprenset ved standardmetoder såsom kromatografi analyseres undertiden ved isoelektrisk fokusering for at sikre deres renhed.