Hva er det isoelektriske punktet?

Proteiner er bygget av kjeder av aminosyrer, som hver har forskjellige pH-verdier. Proteinens totale pH består av blandingen av pH-verdiene til de individuelle aminosyrene når de danner ioner i den spesielle oppløsningen der de er oppløst. Det isoelektriske punktet (pI) til et protein er pH-verdien der proteinet ikke har noen nettoladning. Denne egenskapen kan utnyttes til å skille proteinet med den kjente pl fra andre proteiner i en heterogen blanding.

Aminosyrer har en aminoterminal gruppe som er basisk og har høy pH. Den andre enden av aminosyren er karboksylterminalen som er sur, med lav pH. Ved forskjellige pH-verdier vil aminosyrene på proteinene variere i deres ladninger. Proteiner under deres isoelektriske punkt har en positiv ladning. Derimot har de over dette punktet en negativ ladning.

For å utnytte kunnskapen om det isoelektriske punktet for proteinrensing, blir en blanding av proteiner utsatt for et elektrisk felt. Dette gjøres ofte i agarose- eller polyakrylamidgeler, og er kjent som isoelektrisk fokusering. En eldre teknikk er å utføre prosedyren i større skala i en glaskolonne ved å bruke en løsning av sukrose med elektroder i hver ende. Forbindelser kalt amfolytter blir tilsatt som forårsaker dannelse av en jevn pH-gradient. Når gelen eller kolonnen blir utsatt for den elektriske strømmen, vandrer proteinene til de når sitt isoelektriske punkt, og forblir deretter stasjonære.

Proteiner på geler blir generelt synliggjort av et fargestoff som binder proteiner. Noen ganger, hvis enzymer blir studert, kan et substrat brukes som gir en farget reaksjon. Vanligvis brukes standarder som har proteiner med kjente isoelektriske punkter.

Når man først vet hvor ønsket protein ligger, er en vanlig teknikk å kutte det isolerte proteinet ut av gelen. Proteinet kan deretter renses og sekvenseres. Når sekvensen er kjent, kan den brukes til å designe primere for polymerasekjedereaksjonen (pcr) og brukes til å klone genet for proteinet hvis passende nukleinsyremateriale er tilgjengelig.

Isoelektrisk fokusering er også en vanlig måte å analysere nært beslektede proteiner for å se hvor forskjellige de er fra hverandre. En komplikasjon kan være at proteiner kan ha sukker bundet til seg. Dette kalles glykosylering og kan påvirke proteinets PI. Det kan se ut som det er flere proteiner med forskjellige isoelektriske punkter, når det faktisk bare er ett protein som har blitt differensiert glykosylert. Proteiner renset ved standardmetoder som kromatografi blir noen ganger analysert ved isoelektrisk fokusering for å sikre deres renhet.