Wat is het isoelektrische punt?

Eiwitten zijn opgebouwd uit ketens van aminozuren, die elk verschillende pH-waarden hebben. De totale pH van het eiwit is samengesteld uit het mengsel van de pH-waarden van de afzonderlijke aminozuren wanneer deze ionen vormen in de specifieke oplossing waarin ze worden opgelost. Het isoelektrische punt (pI) van een eiwit is de pH waarbij dat eiwit geen netto lading heeft. Deze eigenschap kan worden benut om het eiwit met de bekende pI te scheiden van andere eiwitten in een heterogeen mengsel.

Aminozuren hebben een amino-terminale groep die basisch is en een hoge pH heeft. Het andere uiteinde van het aminozuur is het carboxyl-uiteinde dat zuur is, met een lage pH. Bij verschillende pH-waarden zullen de aminozuren op de eiwitten variëren in hun lading. Eiwitten onder hun iso-elektrisch punt hebben een positieve lading. Daarentegen hebben die boven dit punt een negatieve lading.

Om de kennis van het isoelektrische punt voor eiwitzuivering te benutten, wordt een mengsel van eiwitten onderworpen aan een elektrisch veld. Dit wordt gewoonlijk gedaan in agarose- of polyacrylamidegels en staat bekend als isoelektrisch focusseren. Een oudere techniek is om de procedure op een grotere schaal uit te voeren in een glazen kolom met behulp van een oplossing van sucrose met elektroden aan elk uiteinde. Verbindingen die amfolyten worden genoemd, worden toegevoegd die de vorming van een consistente pH-gradiënt veroorzaken. Wanneer de gel of kolom wordt onderworpen aan de elektrische stroom, migreren de eiwitten totdat ze hun isoelektrische punt bereiken en blijven dan stationair.

Eiwitten op gels worden in het algemeen zichtbaar gemaakt door een kleurstof die eiwitten bindt. Soms, als enzymen worden bestudeerd, kan een substraat worden gebruikt dat een gekleurde reactie geeft. Gewoonlijk worden standaarden gebruikt die proteïnen met bekende isoelektrische punten hebben.

Zodra men weet waar het gewenste eiwit zich bevindt, is een gebruikelijke techniek om het geïsoleerde eiwit uit de gel te snijden. Het eiwit kan vervolgens worden gezuiverd en de sequentie ervan bepaald. Als de sequentie eenmaal bekend is, kan deze worden gebruikt om primers voor de polymerasekettingreactie (pcr) te ontwerpen en worden gebruikt om het gen voor het eiwit te klonen als geschikt nucleïnezuurmateriaal beschikbaar is.

Iso-elektrisch focussen is ook een veelgebruikte manier om nauw verwante eiwitten te analyseren om te zien hoe verschillend ze van elkaar zijn. Een complicatie kan zijn dat eiwitten suikers eraan kunnen binden. Dit wordt glycosylatie genoemd en kan de pI van het eiwit beïnvloeden. Het kan lijken alsof er meerdere eiwitten zijn met verschillende iso-elektrische punten, terwijl er in feite slechts één eiwit is dat differentieel geglycosyleerd is. Eiwitten die zijn gezuiverd met standaardmethoden zoals chromatografie, worden soms geanalyseerd met isoelektrische focussering om hun zuiverheid te waarborgen.