Was ist der isoelektrische Punkt?
Proteine sind aus Ketten von Aminosäuren aufgebaut, die jeweils unterschiedliche pH-Werte aufweisen. Der Gesamt-pH-Wert des Proteins setzt sich aus der Mischung der pH-Werte der einzelnen Aminosäuren zusammen, wie sie in der jeweiligen Lösung, in der sie gelöst sind, Ionen bilden. Der isoelektrische Punkt (pI) eines Proteins ist der pH-Wert, bei dem dieses Protein keine Nettoladung aufweist. Diese Eigenschaft kann ausgenutzt werden, um das Protein mit dem bekannten pI von anderen Proteinen in einem heterogenen Gemisch zu trennen.
Aminosäuren haben eine aminoterminale Gruppe, die basisch ist und einen hohen pH-Wert aufweist. Das andere Ende der Aminosäure ist das Carboxylende, das sauer ist und einen niedrigen pH-Wert aufweist. Bei unterschiedlichen pH-Werten variieren die Aminosäuren auf den Proteinen in ihren Ladungen. Proteine unterhalb ihres isoelektrischen Punktes sind positiv geladen. Im Gegensatz dazu sind diejenigen über diesem Punkt negativ geladen.
Um die Kenntnis des isoelektrischen Punktes für die Proteinreinigung auszunutzen, wird eine Mischung von Proteinen einem elektrischen Feld ausgesetzt. Dies geschieht üblicherweise in Agarose- oder Polyacrylamidgelen und ist als isoelektrische Fokussierung bekannt. Eine ältere Technik besteht darin, das Verfahren in einem größeren Maßstab in einer Glassäule unter Verwendung einer Saccharoselösung mit Elektroden an jedem Ende durchzuführen. Es werden Ampholyte genannte Verbindungen zugesetzt, die zur Bildung eines gleichmäßigen pH-Gradienten führen. Wenn das Gel oder die Säule dem elektrischen Strom ausgesetzt wird, wandern die Proteine bis zu ihrem isoelektrischen Punkt und bleiben dann stationär.
Proteine auf Gelen werden im Allgemeinen durch einen Farbstoff sichtbar gemacht, der Proteine bindet. Wenn Enzyme untersucht werden, kann manchmal ein Substrat verwendet werden, das eine gefärbte Reaktion ergibt. Üblicherweise werden Standards verwendet, die Proteine mit bekannten isoelektrischen Punkten aufweisen.
Sobald man weiß, wo sich das gewünschte Protein befindet, besteht eine übliche Technik darin, das isolierte Protein aus dem Gel herauszuschneiden. Das Protein kann dann gereinigt und sequenziert werden. Sobald die Sequenz bekannt ist, kann sie zum Entwerfen von Primern für die Polymerasekettenreaktion (pcr) und zum Klonieren des Gens für das Protein verwendet werden, wenn geeignetes Nukleinsäurematerial verfügbar ist.
Die isoelektrische Fokussierung ist auch eine gängige Methode, um eng verwandte Proteine zu analysieren, um festzustellen, wie unterschiedlich sie voneinander sind. Eine Komplikation kann sein, dass an Proteine Zucker gebunden sein kann. Dies wird als Glykosylierung bezeichnet und kann den pI des Proteins beeinflussen. Es könnte so aussehen, als gäbe es mehrere Proteine mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten, obwohl tatsächlich nur ein Protein differentiell glykosyliert wurde. Mit Standardmethoden wie Chromatographie gereinigte Proteine werden manchmal durch isoelektrische Fokussierung analysiert, um ihre Reinheit sicherzustellen.