Jaki jest punkt izoelektryczny?
Białka są zbudowane z łańcuchów aminokwasów, z których każde ma różne wartości pH. Ogólne pH białka składa się z mieszaniny wartości pH poszczególnych aminokwasów, ponieważ tworzą jony w konkretnym roztworze, w którym są rozpuszczone. Punktem izoelektrycznym (PI) białka jest pH, w którym białko nie ma ładunku netto. Ta właściwość można wykorzystać, aby oddzielić białko znanym PI od innych białek w heterogenicznej mieszaninie.
Aminokwasy mają podstawową grupę końcową aminową, mającą wysokie pH. Drugi koniec aminokwasu jest kwaśny terminal karboksylowy o niskim pH. Przy różnych wartościach pH aminokwasy na białkach będą się różnić pod względem ładunków. Białka poniżej ich punktu izoelektrycznego mają ładunek dodatni. Natomiast osoby powyżej tego punktu mają ładunek ujemny.
Aby wykorzystać znajomość punktu izoelektrycznego dla pOczyszczanie rote, mieszanina białek jest poddawana polu elektrycznego. Odbywa się to powszechnie w żelach agarozowych lub poliakryloamidowych i jest znane jako koncentracja izoelektryczna. Starszą techniką jest wykonanie procedury na większą skalę w szklanej kolumnie za pomocą roztworu sacharozy z elektrodami na każdym końcu. Dodano związki zwane amfolitami, które powodują tworzenie spójnego gradientu pH. Gdy żel lub kolumna są poddawane prądowi elektrycznemu, białka migrują, aż osiągną swój punkt izoelektryczny, a następnie pozostają stacjonarne.
Białka na żelach są ogólnie widoczne przez barwnik, który wiąże białka. Czasami, jeśli badane są enzymy, można zastosować substrat, który daje kolorową reakcję. Zwykle stosuje się standardy, które mają białka znanych punktów izoelektrycznych.
Kiedyś wie, gdzie znajduje się pożądane białko, wspólną techniką jest wycięcie izolowanego białka z żelu. Białko można następnie oczyszczyć i zsekwencjonować. Kiedyś sekwencjęCE jest znany, może być stosowany do projektowania starterów dla reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i zastosować do klonowania genu dla białka, jeśli dostępny jest odpowiedni materiał kwasu nukleinowego.
Skupienie izoelektryczne jest również powszechnym sposobem analizy ściśle powiązanych białek, aby zobaczyć, jak różnią się od siebie. Jednym z powikłań może być to, że białka mogą mieć z nimi związane cukry. Nazywa się to glikozylacja i może wpływać na PI białka. Może wyglądać, jakby istnieje wiele białek z różnymi punktami izoelektrycznymi, podczas gdy w rzeczywistości istnieje tylko jedno białko, które było różnie glikozylowane. Białka oczyszczone standardowymi metodami, takimi jak chromatografia, są czasami analizowane przez koncentracja izoelektryczna, aby zapewnić ich czystość.