Co to jest punkt izoelektryczny?

Białka zbudowane są z łańcuchów aminokwasów, z których każdy ma inną wartość pH. Całkowite pH białka składa się z mieszaniny wartości pH poszczególnych aminokwasów, ponieważ tworzą one jony w konkretnym roztworze, w którym są rozpuszczone. Punkt izoelektryczny (pI) białka to pH, przy którym białko to nie ma ładunku netto. Tę właściwość można wykorzystać do oddzielenia białka o znanym pI od innych białek w heterogenicznej mieszaninie.

Aminokwasy mają zasadową grupę aminową, o wysokim pH. Drugi koniec aminokwasu to terminal karboksylowy, który jest kwaśny, o niskim pH. Przy różnych wartościach pH aminokwasy na białkach będą się różnić pod względem ładunku. Białka poniżej punktu izoelektrycznego mają ładunek dodatni. Natomiast te powyżej tego punktu mają ładunek ujemny.

Aby wykorzystać wiedzę o punkcie izoelektrycznym do oczyszczania białka, mieszaninę białek poddaje się działaniu pola elektrycznego. Zwykle odbywa się to w żelach agarozowych lub poliakryloamidowych i jest znane jako ogniskowanie izoelektryczne. Starszą techniką jest przeprowadzanie procedury na większą skalę w szklanej kolumnie przy użyciu roztworu sacharozy z elektrodami na każdym końcu. Dodaje się związki zwane amfolitami, które powodują tworzenie spójnego gradientu pH. Gdy żel lub kolumna są poddawane działaniu prądu elektrycznego, białka migrują, aż osiągną punkt izoelektryczny, a następnie pozostaną nieruchome.

Białka w żelach są na ogół uwidocznione przez barwnik, który wiąże białka. Czasami, jeśli badane są enzymy, można zastosować substrat, który daje barwną reakcję. Zwykle stosuje się standardy zawierające białka o znanych punktach izoelektrycznych.

Gdy wiadomo, gdzie znajduje się pożądane białko, powszechną techniką jest wycinanie izolowanego białka z żelu. Białko można następnie oczyścić i zsekwencjonować. Gdy sekwencja jest znana, można ją wykorzystać do zaprojektowania starterów do reakcji łańcuchowej polimerazy (pcr) i zastosować do klonowania genu dla białka, jeśli dostępny jest odpowiedni materiał kwasu nukleinowego.

Skupienie izoelektryczne jest również powszechnym sposobem analizy blisko spokrewnionych białek, aby zobaczyć, jak różnią się one od siebie. Jednym z komplikacji może być to, że białka mogą wiązać z nimi cukry. Nazywa się to glikozylacją i może wpływać na pI białka. Może się wydawać, że istnieje wiele białek o różnych punktach izoelektrycznych, podczas gdy w rzeczywistości jest tylko jedno białko, które zostało glikozylowane w różny sposób. Białka oczyszczone standardowymi metodami, takimi jak chromatografia, są czasami analizowane przez ogniskowanie izoelektryczne, aby zapewnić ich czystość.