Cos'è il punto isoelettrico?
Le proteine sono costituite da catene di aminoacidi, ognuna delle quali ha valori di pH diversi. Il pH complessivo della proteina è composto dalla miscela dei valori di pH dei singoli aminoacidi mentre formano gli ioni nella particolare soluzione in cui vengono dissolti. Il punto isoelettrico (pI) di una proteina è il pH a cui quella proteina non ha carica netta. Questa proprietà può essere sfruttata per separare la proteina con la pI nota da altre proteine in una miscela eterogenea.
Gli aminoacidi hanno un gruppo amminico basico, con un pH elevato. L'altra estremità dell'amminoacido è il terminale carbossilico che è acido, con un pH basso. A valori di pH diversi, gli aminoacidi sulle proteine varieranno nelle loro cariche. Le proteine al di sotto del loro punto isoelettrico hanno una carica positiva. Al contrario, quelli sopra questo punto hanno una carica negativa.
Per sfruttare la conoscenza del punto isoelettrico per la purificazione delle proteine, una miscela di proteine è soggetta a un campo elettrico. Questo è comunemente fatto con gel di agarosio o poliacrilammide ed è noto come focalizzazione isoelettrica. Una tecnica più antica consiste nell'eseguire la procedura su una scala più ampia in una colonna di vetro usando una soluzione di saccarosio con elettrodi su ciascuna estremità. Vengono aggiunti composti chiamati anfoliti che causano la formazione di un gradiente di pH coerente. Quando il gel o la colonna sono sottoposti alla corrente elettrica, le proteine migrano fino a raggiungere il loro punto isoelettrico, quindi rimangono stazionarie.
Le proteine sui gel sono generalmente rese visibili da un colorante che lega le proteine. A volte, se si studiano gli enzimi, è possibile utilizzare un substrato che dia una reazione colorata. Di solito vengono utilizzati standard che hanno proteine di punti isoelettrici noti.
Una volta che uno sa dove si trova la proteina desiderata, una tecnica comune è quella di tagliare la proteina isolata dal gel. La proteina può quindi essere purificata e sequenziata. Una volta che la sequenza è nota, può essere utilizzata per progettare primer per la reazione a catena della polimerasi (pcr) e per clonare il gene per la proteina se è disponibile materiale adatto per l'acido nucleico.
La focalizzazione isoelettrica è anche un modo comune per analizzare le proteine strettamente correlate per vedere quanto sono diverse l'una dall'altra. Una complicazione può essere che le proteine possono avere zuccheri legati a loro. Questo si chiama glicosilazione e può influenzare la pI della proteina. Può sembrare che ci siano più proteine con diversi punti isoelettrici, quando in realtà c'è solo una proteina che è stata differenziata glicosilata. Le proteine purificate con metodi standard come la cromatografia sono talvolta analizzate mediante focalizzazione isoelettrica per garantirne la purezza.