Quel est le point isoélectrique?
Les protéines sont constituées de chaînes d'acides aminés, chacune ayant un pH différent. Le pH global de la protéine est constitué du mélange des valeurs de pH des acides aminés individuels au moment où ils forment des ions dans la solution particulière dans laquelle ils sont dissous. Le point isoélectrique (pI) d'une protéine est le pH auquel cette protéine n'a pas de charge nette. Cette propriété peut être exploitée pour séparer la protéine avec le pi connu des autres protéines dans un mélange hétérogène.
Les acides aminés ont un groupe amino terminal qui est basique, ayant un pH élevé. L'autre extrémité de l'acide aminé est le carboxyle terminal, acide, à pH bas. A des valeurs de pH différentes, les charges des acides aminés sur les protéines varieront. Les protéines situées en dessous de leur point isoélectrique ont une charge positive. En revanche, ceux au-dessus de ce point ont une charge négative.
Pour exploiter la connaissance du point isoélectrique pour la purification des protéines, un mélange de protéines est soumis à un champ électrique. Ceci est couramment effectué dans des gels d'agarose ou de Polyacrylamide et est connu sous le nom de focalisation isoélectrique. Une technique plus ancienne consiste à effectuer la procédure à plus grande échelle dans une colonne de verre en utilisant une solution de saccharose avec des électrodes à chaque extrémité. Des composés appelés ampholytes sont ajoutés qui entraînent la formation d'un gradient de pH constant. Lorsque le gel ou la colonne est soumis au courant électrique, les protéines migrent jusqu'à ce qu'elles atteignent leur point isoélectrique, puis restent stationnaires.
Les protéines sur les gels sont généralement rendues visibles par un colorant qui lie les protéines. Parfois, si on étudie des enzymes, on peut utiliser un substrat qui donne une réaction colorée. On utilise généralement des standards qui ont des protéines de points isoélectriques connus.
Une fois que l’on sait où se trouve la protéine désirée, une technique courante consiste à couper la protéine isolée du gel. La protéine peut ensuite être purifiée et séquencée. Une fois que la séquence est connue, elle peut être utilisée pour concevoir des amorces pour la réaction en chaîne de la polymérase (pcr) et pour cloner le gène de la protéine si un acide nucléique approprié est disponible.
La focalisation isoélectrique est également un moyen courant d’analyser des protéines étroitement apparentées afin de déterminer leur différence. Une complication peut être que les protéines peuvent avoir des sucres qui leur sont liés. Ceci s'appelle glycosylation et peut affecter le pI de la protéine. Il peut sembler qu'il existe plusieurs protéines avec différents points isoélectriques, alors qu'en fait, il n'y a qu'une seule protéine qui a été glycosylée de manière différentielle. Les protéines purifiées par des méthodes classiques telles que la chromatographie sont parfois analysées par focalisation isoélectrique pour assurer leur pureté.