Qual é o ponto isoelétrico?
As proteínas são constituídas de cadeias de aminoácidos, cada uma com diferentes valores de pH. O pH geral da proteína é composto pela mistura dos valores de pH dos aminoácidos individuais, pois eles formam íons na solução específica em que são dissolvidos. O ponto isoelétrico (pI) de uma proteína é o pH no qual essa proteína não possui carga líquida. Esta propriedade pode ser explorada para separar a proteína com o pI conhecido de outras proteínas em uma mistura heterogênea.
Os aminoácidos têm um grupo amino terminal básico, com um pH alto. A outra extremidade do aminoácido é o terminal carboxílico que é ácido, com um pH baixo. Em valores de pH diferentes, os aminoácidos das proteínas variam em suas cargas. As proteínas abaixo do seu ponto isoelétrico têm uma carga positiva. Por outro lado, aqueles acima deste ponto têm uma carga negativa.
Para explorar o conhecimento do ponto isoelétrico da purificação de proteínas, uma mistura de proteínas é submetida a um campo elétrico. Isso geralmente é feito em géis de agarose ou poliacrilamida e é conhecido como foco isoelétrico. Uma técnica mais antiga é executar o procedimento em uma escala maior em uma coluna de vidro usando uma solução de sacarose com eletrodos em cada extremidade. São adicionados compostos chamados anfólitos que causam a formação de um gradiente de pH consistente. Quando o gel ou coluna é submetido à corrente elétrica, as proteínas migram até atingir seu ponto isoelétrico e permanecem estacionárias.
As proteínas dos géis são geralmente tornadas visíveis por um corante que liga as proteínas. Às vezes, se estiverem sendo estudadas enzimas, pode ser usado um substrato que produz uma reação colorida. Geralmente são utilizados padrões que possuem proteínas de pontos isoelétricos conhecidos.
Uma vez que se sabe onde está localizada a proteína desejada, uma técnica comum é cortar a proteína isolada do gel. A proteína pode então ser purificada e sequenciada. Uma vez conhecida a sequência, ela pode ser usada para projetar iniciadores para a reação em cadeia da polimerase (pcr) e usada para clonar o gene da proteína se houver material adequado de ácido nucleico disponível.
O foco isoelétrico também é uma maneira comum de analisar proteínas intimamente relacionadas para ver quão diferentes elas são umas das outras. Uma complicação pode ser que as proteínas podem ter açúcares ligados a elas. Isso é chamado de glicosilação e pode afetar o pI da proteína. Pode parecer que existem várias proteínas com diferentes pontos isoelétricos, quando na verdade há apenas uma proteína que foi diferencialmente glicosilada. As proteínas purificadas por métodos padrão como a cromatografia são algumas vezes analisadas por foco isoelétrico para garantir sua pureza.