Wat is ELISA-detectie?
Een enzymgebonden immunosorbentassay (ELISA) is een test die in een immunologisch laboratorium wordt uitgevoerd om eiwitniveaus in een biologisch monster te bepalen. ELISA-detectie verwijst naar de laatste stap van de test waarin een heldere oplossing of substraat wordt toegevoegd aan een plastic plaat die gebonden enzym-gelabeld antilichaam bevat. Het enzym splitst het substraat en er treedt een kleurverandering op. Lichtabsorptie van de uiteindelijke gekleurde oplossing wordt vervolgens gemeten op een ELISA-plaatlezer of spectrofotometer.
Er zijn verschillende soorten ELISA-tests, waarvan de twee meest voorkomende de indirecte ELISA en de capture, of sandwich, ELISA zijn. De indirecte ELISA wordt gebruikt om een eiwit, bekend als een antilichaam, in het serum van een patiënt te detecteren. Een voorbeeld van een indirecte ELISA-test is de humane immunodeficiëntievirus (HIV) -test die wordt gebruikt om antilichamen tegen HIV te detecteren. De sandwich ELISA-test detecteert een eiwit of antigeen door het tussen twee antilichamen te vangen. Detectie van het hormoon humaan choriongonadotrofine (hCG), dat tijdens de zwangerschap wordt verhoogd, wordt gedaan met een sandwich ELISA-test.
Beide tests hebben een ELISA-detectiestap aan het einde van de test. Deze stap omvat de toevoeging van een antilichaam waaraan een enzymmolecuul is bevestigd. Na de toevoeging van het met enzym gemerkte antilichaam wordt een kleurloze oplossing toegevoegd, die het substraatmolecuul bevat dat specifiek is voor dat enzym. Het enzym splitst het substraatmolecuul en de oplossing verandert van kleur afhankelijk van de gebruikte combinatie. Bepaling van de hoeveelheid antilichaam of antigeen in het monster van de patiënt wordt gedaan door de intensiteit van de kleurverandering te meten.
Er zijn verschillende combinaties van enzymsubstraten beschikbaar voor gebruik in de ELISA-detectiestap. Het meest voorkomende enzym is mierikswortelperoxidase (HRP), dat onder andere de substraatmoleculen ortho-fenyleendiaminedihydrochloride (OPD) en tetramethylbenzidine (TMB) kan splitsen. Splitsing van zowel OPD als TMB resulteert in een gele kleur en de optische dichtheid of absorptie van licht van deze substraten wordt gemeten door een ELISA-plaatlezer. De lichtabsorptie van OPD wordt gemeten bij een golflengte van 490 nanometer (nm) terwijl TMB wordt gemeten bij 450 nm.
Een ander veel voorkomend enzym dat wordt gebruikt in de ELISA-detectiestap is alkalische fosfatase. Dit enzym wordt gebruikt met het substraat p-nitrofenylfosfaat (PNPP) en produceert ook een gele oplossing. PNPP absorbeert licht met een golflengte van 405 nm.
Selectie van de enzymsubstraatcombinaties is meestal gebaseerd op welke enzym-gelabelde antilichamen in de handel verkrijgbaar zijn, evenals welke apparatuur zal worden gebruikt om lichtabsorptie te meten. De vele beschikbare combinaties voor ELISA-detectie maken de ELISA-test zeer veelzijdig. Het is een belangrijk hulpmiddel in ziektetests en onderzoekslaboratoria.