Co je detekce ELISA?
Enzym spojený imunosorbent test (ELISA) je test prováděný v imunologické laboratoři pro stanovení hladin proteinu v biologickém vzorku. Detekce ELISA se týká posledního kroku testu, ve kterém je do plastové desky obsahující vázanou protilátku značenou enzym přidán jasný roztok nebo substrát. Enzym štěpí substrát a dochází ke změně barvy. Absorbance světla konečného barevného roztoku se poté měří na čtečce nebo spektrofotometru ELISA. Nepřímá ELISA se používá k detekci proteinu, známého jako protilátka, v séru pacienta. Příkladem nepřímého testu ELISA je test viru lidské imunodeficience (HIV) používaný k detekci protilátek proti HIV. Test sendvičového ELISA detekuje protein nebo antigen, zachycení mezi dvěma protilátkami. Detekce hormonu lidského chorionického gonadotropinu (HCG), což je Evybírán během těhotenství, provádí se sendvičovým testem ELISA.
Oba testy mají na konci testu detekční krok ELISA. Tento krok zahrnuje přidání protilátky, která má k ní připojenou molekulu enzymu. Po přidání enzymově značené protilátky se přidá bezbarvý roztok obsahující molekulu substrátu specifickou pro tento enzym. Enzym štěpí molekulu substrátu a roztok mění barvu v závislosti na použité kombinaci. Stanovení množství protilátky nebo antigenu ve vzorku pacienta se provádí měřením intenzity změny barvy.
Existuje několik kombinací substrátu enzymů pro použití v detekčním kroku ELISA. Nejběžnějším enzymem je křenová peroxidáza (HRP), která může mimo jiné štěpit molekuly substrátu ortho-fenylemendiamin dihydrochlorid (OPD) a tetramethylbenzidin (TMB). Štěpení obou OPDa TMB má za následek žlutou barvu a optická hustota nebo absorbance světla těchto substrátů se měří čtečkou desky ELISA. Absorbance OPD se měří na vlnové délce 490 nanometrů (nm), zatímco TMB se měří při 450 nm.
Dalším běžným enzymem použitým v detekčním kroku ELISA je alkalická fosfatáza. Tento enzym se používá se substrátem p-nitrofenylfosfátem (PNPP) a také produkuje žlutý roztok. PNPP absorbuje světlo na vlnové délce 405 nm.
Výběr kombinací substrátu enzymu je obvykle založen na tom, jaké protilátky značené enzymem jsou komerčně dostupné a také jaké zařízení bude použito k měření absorbance světla. Mnoho kombinací dostupných pro detekci ELISA činí test ELISA velmi všestranným. Je to důležitý nástroj při testování nemocí a výzkumných laboratořích.