Co je detekce ELISA?
Enzymaticky vázaný imunosorbentový test (ELISA) je test prováděný v imunologické laboratoři za účelem stanovení hladin proteinu v biologickém vzorku. Detekce ELISA se týká posledního kroku testu, ve kterém je čirý roztok nebo substrát přidán k plastové desce obsahující navázanou enzymem značenou protilátku. Enzym štěpí substrát a dochází ke změně barvy. Absorbance světla konečného barevného roztoku se pak měří na čtečce destiček ELISA nebo na spektrofotometru.
Existují různé typy testů ELISA, přičemž dva nejběžnější jsou nepřímá ELISA a záchyt nebo sendvič ELISA. Nepřímá ELISA se používá k detekci proteinu, známého jako protilátka, v séru pacienta. Příkladem nepřímého testu ELISA je test viru lidské imunodeficience (HIV) používaný k detekci protilátek proti HIV. Sendvičový test ELISA detekuje protein nebo antigen zachycením mezi dvěma protilátkami. Detekce hormonu lidského chorionického gonadotropinu (hCG), který je během těhotenství zvýšen, se provádí sendvičovým testem ELISA.
Oba testy mají na konci testu detekční krok ELISA. Tento krok zahrnuje přidání protilátky, ke které je připojena molekula enzymu. Po přidání protilátky značené enzymem se přidá bezbarvý roztok obsahující molekulu substrátu specifickou pro tento enzym. Enzym štěpí substrátovou molekulu a roztok mění barvu v závislosti na použité kombinaci. Stanovení množství protilátky nebo antigenu ve vzorku pacienta se provádí měřením intenzity změny barvy.
K dispozici je několik kombinací enzymových substrátů pro použití v detekčním kroku ELISA. Nejběžnějším enzymem je křenová peroxidáza (HRP), která může mimo jiné štěpit substrátové molekuly orto-fenylenediamin-dihydrochlorid (OPD) a tetramethylbenzidin (TMB). Štěpení OPD i TMB má za následek žluté zbarvení a optická hustota nebo absorbance světla těchto substrátů se měří čtečkou destiček ELISA. Absorpce světla OPD se měří při vlnové délce 490 nanometrů (nm), zatímco TMB se měří při 450 nm.
Dalším běžným enzymem použitým v detekčním kroku ELISA je alkalická fosfatáza. Tento enzym se používá se substrátem p-nitrofenylfosfátu (PNPP) a také vytváří žlutý roztok. PNPP absorbuje světlo při vlnové délce 405 nm.
Výběr kombinací enzymového substrátu je obvykle založen na tom, které enzymem značené protilátky jsou komerčně dostupné, a na jakém vybavení bude použito k měření absorbance světla. Mnoho kombinací dostupných pro detekci ELISA činí test ELISA vysoce univerzálním. Je to důležitý nástroj pro testování chorob a výzkumné laboratoře.