Hva er et rekombinant plasmid?

Et plasmid er et sirkulært stykke DNA som finnes i mange bakterier. Det mest bemerkelsesverdige trekk ved plasmider er at de replikerer uavhengig av vertens viktigste DNA. Ofte brukes et plasmid i rekombinant kloningsteknologi for å klone nyisolerte gener. Det er også veldig vanlig å bruke et rekombinant plasmid for å uttrykke store mengder av et kjent gen for å få RNA eller protein fra det. Slik rekombinant genuttrykk har vært uunnværlig for bioteknologibransjen.

Rekombinante plasmider ble først utviklet i labrotten i bakterieverdenen, Escherichia coli . Mange andre typer bakterier kan inneholde slike plasmider. Disse bitene med selvreplikerende DNA kan overføres naturlig mellom forskjellige typer bakterier. Til tross for dette var det noen ganger vanskelig å introdusere de rekombinante plasmidene i andre typer bakterier.

Den primære prosedyren for å introdusere DNA i andre celler er kjent som transformasjon, der bakteriene behandles med kjemikalier som gjør dem mer sannsynlig å ta opp fremmed DNA. En annen teknikk innebærer å sjokkere bakteriene med en elektrisk strøm. Dette er kjent som elektroporering.

Årsakene til å lage et rekombinant plasmid varierer. Ofte når DNA først isoleres fra et bestemt vev eller organisme, blir det transformert til plasmider for å lage et bibliotek. Da kan DNA ekstraheres fra individuelle kolonier. Deretter kan de bli screenet ved DNA-sekvensering for å bestemme hvilke typer gener som er til stede, hvis sekvensene er til stede i en database. Noen ganger klones gener med ukjente funksjoner.

I andre tilfeller er genproduktet godt kjent, men forskerne ønsker å uttrykke store mengder av det for videre studier. Genet kan klones til rekombinante plasmider som er overekspresjonsvektorer. De er designet spesielt for å produsere store mengder RNA eller protein. Dette har vært spesielt verdifullt for rekombinante humane proteiner, som tidligere bare var tilgjengelige fra kadavre, noe som gjorde det veldig vanskelig å studere funksjonen til et bestemt gen.

Flere faktorer er involvert i konstruksjon av et plasmid som kan brukes i molekylær kloning. Plasmidet må ha en markør som kan velges. Dette gjør det mulig å velge en celle med genet. Normalt antall nummererer populasjonen av celler som mangler genet med markøren i stor grad mengden celler som bærer det. Generelt har et rekombinant plasmid resistens mot et antibiotikum, eller kan vokse i fravær av en bestemt aminosyre.

Et slikt plasmid trenger replikasjonsoriginalitet slik at det kan begynne å syntetisere det rekombinante DNA-et. I tillegg krever et rekombinant plasmid et sett med spesielle sekvenser for å tillate et restriksjonsenzym å spalte DNA for å tillate et gen å bli satt inn i kloningsvektoren. Det er et stort antall restriksjonsenzymer som er svært spesialiserte for spesifikke DNA-sekvenser som må være til stede der genet starter og slutter.

Tradisjonelle bakteriestammer har blitt brukt til DNA-kloning i flere tiår. I tillegg er det nye sett som bruker spesialkonstruerte bakteriestammer for å lette overuttrykk av genproduktet. De kombinerer teknologien for kloning av et gen med en metode som muliggjør enkel rensing av proteinet uttrykt fra genet når det først er klonet inn i det rekombinante plasmidet.