Qu'est-ce qu'un plasmide recombinant?
Un plasmide est un fragment d'ADN circulaire présent dans de nombreuses bactéries. La caractéristique la plus notable des plasmides est qu'ils se répliquent indépendamment de l'ADN principal de l'hôte. Un plasmide est souvent utilisé dans la technologie de clonage recombinant pour cloner des gènes récemment isolés. Il est également très courant d'utiliser un plasmide recombinant pour exprimer de grandes quantités d'un gène connu afin d'obtenir un ARN ou une protéine à partir de celui-ci. Une telle expression génique recombinante a été indispensable pour l'industrie des biotechnologies.
Les plasmides recombinants ont été développés pour la première fois chez le rat de laboratoire du monde bactérien, Escherichia coli . De nombreux autres types de bactéries peuvent héberger de tels plasmides. Ces fragments d'ADN auto-répliquant peuvent être transférés naturellement entre différents types de bactéries. Malgré cela, il était parfois difficile d’introduire les plasmides recombinants dans d’autres types de bactéries.
La principale procédure d’introduction d’ADN dans d’autres cellules est la transformation, dans laquelle les bactéries sont traitées avec des produits chimiques qui les rendent plus susceptibles d’absorber de l’ADN étranger. Une autre technique consiste à électrocuter les bactéries avec un courant électrique. Ceci est connu comme électroporation.
Les raisons de créer un plasmide recombinant varient. Souvent, lorsque l'ADN est isolé pour la première fois d'un tissu ou d'un organisme particulier, il est transformé en plasmides pour créer une banque. Ensuite, l'ADN peut être extrait de colonies individuelles. Ensuite, ils peuvent être criblés par séquençage d'ADN pour déterminer quels types de gènes sont présents, si les séquences sont présentes dans une base de données. Parfois, des gènes avec des fonctions inconnues sont clonés.
Dans d'autres cas, le produit du gène est bien connu, mais les chercheurs souhaitent en exprimer de grandes quantités pour étude ultérieure. Le gène peut être clone dans des plasmides recombinants qui sont des vecteurs de surexpression. Ils sont spécialement conçus pour produire de grandes quantités d'ARN ou de protéines. Cela a été particulièrement utile pour les protéines humaines recombinantes, qui auparavant n'étaient souvent disponibles que chez les cadavres, rendant très difficile l'étude de la fonction d'un gène particulier.
Plusieurs facteurs sont impliqués dans la construction d'un plasmide utilisable dans le clonage moléculaire. Le plasmide doit avoir un marqueur sélectionnable. Cela permet de sélectionner une cellule avec le gène. Normalement, la population de cellules dépourvues du gène avec le marqueur dépasse largement le nombre de cellules qui le portent. Généralement, un plasmide recombinant présente une résistance à un antibiotique ou peut croître en l'absence d'un acide aminé particulier.
Un tel plasmide a besoin d'une origine de réplication pour pouvoir synthétiser son ADN recombinant. De plus, un plasmide recombinant nécessite un ensemble de séquences spéciales pour permettre à une enzyme de restriction de cliver l'ADN afin de permettre l'insertion d'un gène dans le vecteur de clonage. Il existe un grand nombre d'enzymes de restriction hautement spécialisées pour des séquences d'ADN spécifiques qui doivent être présentes au début et à la fin du gène.
Les souches de bactéries traditionnelles sont utilisées pour le clonage de l'ADN depuis des décennies. En outre, de nouveaux kits utilisent des souches bactériennes spécialement conçues pour faciliter la surexpression du produit du gène. Ils associent la technologie de clonage d’un gène à une méthode permettant de purifier facilement la protéine exprimée à partir du gène une fois celle-ci clonée dans le plasmide recombinant.