Co je to rekombinantní plazmid?

Plazmid je kruhový kus DNA, který se nachází v mnoha bakteriích. Nejvýznamnějším rysem plazmidů je to, že se replikují nezávisle na hlavní DNA hostitele. Plazmid se často používá v technologii rekombinantního klonování pro klonování nově izolovaných genů. Je také velmi běžné používat rekombinantní plazmid k expresi velkého množství známého genu pro získání RNA nebo proteinu z něj. Taková exprese rekombinantního genu byla nezbytná pro biotechnologický průmysl.

Rekombinantní plazmidy byly poprvé vyvinuty v laboratorním potkani bakteriálního světa, Escherichia coli . Mnoho dalších typů bakterií může takové plazmidy uchovávat. Tyto kousky samoreplikující se DNA se mohou přirozeně přenášet mezi různými typy bakterií. Navzdory tomu bylo někdy obtížné zavádět rekombinantní plazmidy do jiných druhů bakterií.

Primární postup pro zavedení DNA do jiných buněk je známý jako transformace, při které jsou bakterie ošetřeny chemikáliemi, díky nimž je větší pravděpodobnost, že přijmou cizí DNA. Další technika zahrnuje šokování bakterií elektrickým proudem. Toto je známé jako elektroporace.

Důvody pro vytvoření rekombinantního plazmidu se liší. Když je DNA poprvé izolována z konkrétní tkáně nebo organismu, je často transformována do plazmidů za účelem vytvoření knihovny. Potom může být DNA extrahována z jednotlivých kolonií. Dále mohou být skrínovány sekvenováním DNA, aby se určilo, jaké typy genů jsou přítomny, pokud jsou sekvence přítomny v databázi. Někdy jsou geny s neznámými funkcemi klonovány.

V jiných případech je genový produkt dobře známý, ale vědci si přejí vyjádřit jeho velké množství pro další studium. Gen může být klonován do rekombinantních plasmidů, které jsou nadexpresními vektory. Jsou určeny zejména k produkci velkého množství RNA nebo bílkovin. Toto bylo obzvláště cenné pro rekombinantní lidské proteiny, které dříve byly často dostupné pouze od mrtvol, což velmi ztěžovalo studium funkce konkrétního genu.

Při konstrukci plazmidu, který lze použít při molekulárním klonování, se podílí několik faktorů. Plazmid musí mít volitelný marker. To umožňuje vybrat buňku s genem. Normálně populace buněk postrádajících gen se markerem značně převyšuje množství buněk, které jej nesou. Obecně má rekombinantní plazmid rezistenci na antibiotikum nebo může růst v nepřítomnosti konkrétní aminokyseliny.

Takový plazmid potřebuje počátek replikace, aby mohl začít syntetizovat svou rekombinantní DNA. Kromě toho rekombinantní plazmid vyžaduje sadu speciálních sekvencí, které umožňují restrikčnímu enzymu štěpit DNA a umožnit vložení genu do klonovacího vektoru. Existuje velké množství restrikčních enzymů, které se vysoce specializují na specifické sekvence DNA, které musí být přítomny tam, kde gen začíná a končí.

Tradiční kmeny bakterií se používají klonování DNA po celá desetiletí. Kromě toho existují nové sady, které používají speciálně konstruované bakteriální kmeny k usnadnění nadměrné exprese genového produktu. Kombinují technologii klonování genu se způsobem, který umožňuje snadné čištění proteinu exprimovaného z genu, jakmile byl klonován do rekombinantního plazmidu.