Was ist ein rekombinantes Plasmid?
Ein Plasmid ist ein kreisförmiges DNA-Stück, das in vielen Bakterien vorkommt. Das bemerkenswerteste Merkmal von Plasmiden ist, dass sie sich unabhängig von der Haupt-DNA des Wirts replizieren. Oft wird ein Plasmid in der rekombinanten Klonierungstechnologie verwendet, um neu isolierte Gene zu klonieren. Es ist auch sehr üblich, ein rekombinantes Plasmid zu verwenden, um große Mengen eines bekannten Gens zu exprimieren, um daraus RNA oder Protein zu erhalten. Eine solche rekombinante Genexpression war für die Biotechnologieindustrie unverzichtbar.
Rekombinante Plasmide wurden zuerst in der Laborratte der Bakterienwelt Escherichia coli entwickelt . Viele andere Arten von Bakterien können solche Plasmide beherbergen. Diese sich selbst replizierenden DNA-Teile können auf natürliche Weise zwischen verschiedenen Arten von Bakterien übertragen werden. Trotzdem war es manchmal schwierig, die rekombinanten Plasmide in andere Arten von Bakterien einzuführen.
Das primäre Verfahren zum Einbringen von DNA in andere Zellen ist als Transformation bekannt, bei der die Bakterien mit Chemikalien behandelt werden, die die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass sie Fremd-DNA aufnehmen. Eine andere Technik beinhaltet das Schocken der Bakterien mit elektrischem Strom. Dies ist als Elektroporation bekannt.
Die Gründe für die Erzeugung eines rekombinanten Plasmids variieren. Wenn DNA zum ersten Mal aus einem bestimmten Gewebe oder Organismus isoliert wird, wird sie häufig in Plasmide transformiert, um eine Bibliothek zu erstellen. Dann kann DNA aus einzelnen Kolonien extrahiert werden. Als nächstes können sie durch DNA-Sequenzierung gescreent werden, um zu bestimmen, welche Arten von Genen vorhanden sind, wenn die Sequenzen in einer Datenbank vorhanden sind. Manchmal werden Gene mit unbekannten Funktionen geklont.
In anderen Fällen ist das Genprodukt gut bekannt, aber die Forscher möchten große Mengen davon für weitere Untersuchungen exprimieren. Das Gen kann in rekombinante Plasmide kloniert werden, die Überexpressionsvektoren sind. Sie sind speziell für die Produktion großer Mengen an RNA oder Protein konzipiert. Dies war besonders wertvoll für rekombinante humane Proteine, die früher oft nur von Leichen erhältlich waren, was es sehr schwierig machte, die Funktion eines bestimmten Gens zu untersuchen.
Bei der Konstruktion eines Plasmids, das beim molekularen Klonieren verwendet werden kann, sind verschiedene Faktoren beteiligt. Das Plasmid muss einen selektierbaren Marker haben. Dies ermöglicht die Selektion einer Zelle mit dem Gen. Normalerweise übersteigt die Population von Zellen, denen das Gen mit dem Marker fehlt, die Menge der Zellen, die es tragen, erheblich. Im Allgemeinen weist ein rekombinantes Plasmid eine Resistenz gegen ein Antibiotikum auf oder kann in Abwesenheit einer bestimmten Aminosäure wachsen.
Ein solches Plasmid benötigt einen Replikationsursprung, damit es beginnen kann, seine rekombinante DNA zu synthetisieren. Zusätzlich erfordert ein rekombinantes Plasmid einen Satz spezieller Sequenzen, damit ein Restriktionsenzym die DNA spalten kann, damit ein Gen in den Klonierungsvektor eingefügt werden kann. Es gibt eine große Anzahl von Restriktionsenzymen, die auf bestimmte DNA-Sequenzen spezialisiert sind, die dort vorhanden sein müssen, wo das Gen beginnt und endet.
Traditionelle Bakterienstämme werden seit Jahrzehnten zum DNA-Klonen verwendet. Darüber hinaus gibt es neue Kits, die speziell konstruierte Bakterienstämme verwenden, um eine Überexpression des Genprodukts zu erleichtern. Sie kombinieren die Technologie zur Klonierung eines Gens mit einer Methode, die eine einfache Reinigung des aus dem Gen exprimierten Proteins ermöglicht, sobald es in das rekombinante Plasmid kloniert wurde.