Hvad er et rekombinant plasmid?

Et plasmid er et cirkulært stykke DNA, der findes i mange bakterier. Det mest bemærkelsesværdige træk ved plasmider er, at de replikerer uafhængigt af værtens vigtigste DNA. Ofte bruges et plasmid i rekombinant kloningsteknologi til kloning af nyligt isolerede gener. Det er også meget almindeligt at anvende et rekombinant plasmid til at udtrykke store mængder af et kendt gen til opnåelse af RNA eller protein fra det. En sådan rekombinant genekspression har været uundværlig for bioteknologisektoren.

Rekombinante plasmider blev først udviklet i labrotten i bakterieverdenen, Escherichia coli . Mange andre typer bakterier kan have sådanne plasmider. Disse bit af selvreplicerende DNA kan overføres naturligt mellem forskellige typer bakterier. På trods af dette var det undertiden vanskeligt at introducere de rekombinante plasmider i andre slags bakterier.

Den primære procedure til introduktion af DNA i andre celler er kendt som transformation, hvor bakterierne behandles med kemikalier, der gør dem mere tilbøjelige til at optage fremmed DNA. En anden teknik involverer chokering af bakterierne med en elektrisk strøm. Dette er kendt som elektroporation.

Årsagerne til at danne et rekombinant plasmid varierer. Når DNA først isoleres fra et bestemt væv eller organisme, omdannes det til plasmider for at skabe et bibliotek. Derefter kan DNA ekstraheres fra individuelle kolonier. Dernæst kan de screenes ved DNA-sekventering for at bestemme, hvilke typer gener der er til stede, hvis sekvenserne er til stede i en database. Nogle gange klones gener med ukendte funktioner.

I andre tilfælde er genproduktet velkendt, men forskerne ønsker at udtrykke store mængder af det til videre undersøgelse. Genet kan klones i rekombinante plasmider, der er overekspressionsvektorer. De er specielt designet til at producere store mængder RNA eller protein. Dette har været særlig værdifuldt for rekombinante humane proteiner, som tidligere kun var tilgængelige fra kadavre, hvilket gjorde det meget vanskeligt at studere funktionen af ​​et bestemt gen.

Flere faktorer er involveret i konstruktion af et plasmid, der kan anvendes til molekylær kloning. Plasmidet skal have en markør, der kan vælges. Dette gør det muligt at vælge en celle med genet. Normalt udtæller populationen af ​​celler, der mangler genet med markøren, i høj grad antallet af celler, der bærer det. Generelt har et rekombinant plasmid resistens over for et antibiotikum eller kan vokse i fravær af en bestemt aminosyre.

Et sådant plasmid har brug for en replikationsorigin, så det kan begynde at syntetisere dets rekombinante DNA. Derudover kræver et rekombinant plasmid et sæt af specielle sekvenser for at tillade et restriktionsenzym at spalte DNA'et for at tillade et gen at blive indsat i kloningsvektoren. Der er et stort antal restriktionsenzymer, der er yderst specialiserede til specifikke DNA-sekvenser, der skal være til stede, hvor genet starter og slutter.

Traditionelle bakteriestammer er blevet anvendt til DNA-kloning i årtier. Der er desuden nye sæt, der bruger specielt konstruerede bakteriestammer til at lette overekspression af genproduktet. De kombinerer teknologien til kloning af et gen med en metode, der muliggør let oprensning af proteinet, der udtrykkes fra genet, når det først er blevet klonet i det rekombinante plasmid.