O que é um plasmídeo recombinante?
Um plasmídeo é um pedaço circular de DNA encontrado em muitas bactérias. A característica mais notável dos plasmídeos é que eles se replicam independentemente do DNA principal do hospedeiro. Freqüentemente, um plasmídeo é usado na tecnologia de clonagem recombinante para clonar genes recém-isolados. Também é muito comum usar um plasmídeo recombinante para expressar grandes quantidades de um gene conhecido para obter RNA ou proteína a partir dele. Essa expressão gênica recombinante tem sido indispensável para a indústria de biotecnologia.
Os plasmídeos recombinantes foram desenvolvidos pela primeira vez no rato de laboratório do mundo bacteriano, Escherichia coli . Muitos outros tipos de bactérias podem abrigar esses plasmídeos. Esses pedaços de DNA auto-replicante podem se transferir naturalmente entre diferentes tipos de bactérias. Apesar disso, às vezes era difícil introduzir os plasmídeos recombinantes em outros tipos de bactérias.
O procedimento primário para a introdução de DNA em outras células é conhecido como transformação, na qual as bactérias são tratadas com produtos químicos que as tornam mais propensas a absorver DNA estranho. Outra técnica envolve chocar as bactérias com uma corrente elétrica. Isso é conhecido como eletroporação.
Os motivos para criar um plasmídeo recombinante variam. Freqüentemente, quando o DNA é isolado pela primeira vez a partir de um determinado tecido ou organismo, é transformado em plasmídeo para criar uma biblioteca. Então o DNA pode ser extraído de colônias individuais. Em seguida, eles podem ser rastreados por sequenciamento de DNA para determinar quais tipos de genes estão presentes, se as seqüências estão presentes em um banco de dados. Às vezes, genes com funções desconhecidas são clonados.
Em outros casos, o produto genético é bem conhecido, mas os pesquisadores desejam expressar grandes quantidades para estudos adicionais. O gene pode ser clonado em plasmídeos recombinantes que são vetores de superexpressão. Eles são projetados especialmente para produzir grandes quantidades de RNA ou proteína. Isso tem sido particularmente valioso para proteínas humanas recombinantes, que anteriormente estavam disponíveis apenas em cadáveres, dificultando o estudo da função de um determinado gene.
Vários fatores estão envolvidos na construção de um plasmídeo que pode ser usado na clonagem molecular. O plasmídeo deve ter um marcador selecionável. Isso torna possível selecionar uma célula com o gene. Normalmente, a população de células sem o gene com o marcador excede em muito o número de células que o transportam. Geralmente um plasmídeo recombinante tem resistência a um antibiótico ou pode crescer na ausência de um aminoácido específico.
Esse plasmídeo precisa de uma origem de replicação para poder começar a sintetizar seu DNA recombinante. Além disso, um plasmídeo recombinante requer um conjunto de sequências especiais para permitir que uma enzima de restrição cliva o DNA para permitir que um gene seja inserido no vetor de clonagem. Há um grande número de enzimas de restrição altamente especializadas para sequências de DNA específicas que devem estar presentes onde o gene inicia e termina.
Cepas tradicionais de bactérias têm sido usadas para clonagem de DNA há décadas. Além disso, existem novos kits que usam cepas bacterianas especialmente construídas para facilitar a super expressão do produto genético. Eles combinam a tecnologia para clonar um gene com um método que permite a fácil purificação da proteína expressa a partir do gene, uma vez que foi clonada no plasmídeo recombinante.