Was ist ein Ubiquitination Assay?

Ubiquitinierung bezieht sich auf die Bindung des Proteins Ubiquitin an andere Proteine ​​durch drei verschiedene Enzyme. Ein Ubiquitinierungsassay ist ein Test, der bestimmt, wie viel von diesem Prozess in der Zelle abläuft. Mithilfe von Tests kann ermittelt werden, wie sich unterschiedliche Bedingungen auf die Proteinbindung, Schritte und Strukturen auswirken, die für den Ubiquitinnationsweg und die Proteinmenge in der Zelle wichtig sind. Unzureichende oder übermäßige Mengen wurden mit der Entwicklung vieler verschiedener Krankheiten in Verbindung gebracht.

Ubiquitin ist ein in Zellen vorkommendes Protein, dessen Funktion darin besteht, an Proteine ​​zu binden und gleichzeitig als "Tag" oder Signal für andere Strukturen zu fungieren. Dieses "Tag" signalisiert dann Enzymen, dass das Protein zerstört, recycelt oder bewegt werden kann. Das Ergebnis ist die Zerstörung oder der Transport von Proteinen.

Diese Markierungsproteine ​​sind wichtig für die DNA-Reparatur, Virusinfektionen und Immunantwort. Andere wichtige Funktionen umfassen Rollen beim Zelltod, der Zellteilung und der Entwicklung von Zellen. Zu viel Ubiquitin oder ein Mangel an Ubiquitin kann bei der Entstehung vieler Krankheiten wie Krebs, genetischen Störungen und Erkrankungen des Immunsystems eine Rolle spielen.

Die Forscher werden einen Ubiquitinierungsassay verwenden, um zu bestimmen, welche Bedingungen die Konzentration des Proteins in der Zelle verändern, und um erkrankte Zellen mit gesunden Zellen zu vergleichen. Wissenschaftler untersuchen damit auch, unter welchen Bedingungen sich die Bindung ändert. Zusätzlich könnten sie versuchen, einen spezifischen DNA-Code mit der Menge an Enzymen in der Zelle zu verknüpfen.

Es gibt mehr als eine Art von Ubiquitinierungs-Assay, die Forscher speziell verwenden. Man wird den Prozentsatz der Proteine ​​bestimmen, die an Ubiquintin gebunden sind. Ein anderes untersucht die Aktivität von Enzymen oder das Vorhandensein anderer Intermediate im Ubiquinierungsweg. Basierend auf dem Zielprotein, an das Ubiquitin bindet, werden verschiedene Tests entwickelt.

Die Grundlage eines Ubiquitinierungsassays ist der Einbau einer Verbindung, die mit einer anderen, leicht zu messenden Chemikalie markiert wird. In onkologischen Tests kann Ubiquitin mit Cryptate markiert werden, einer Verbindung, die zwei Stickstoffatome enthält. Dies kann verwendet werden, um zu bestimmen, welches Enzym in der Zelle am aktivsten ist.

Ein Ubiquitinierungsassay besteht aus zwei Schritten. Der erste ist ein enzymatischer Schritt, bei dem Enzyme das markierte Ubiquitin an das Zielprotein binden. Der zweite Schritt ist ein Nachweisschritt, bei dem die Bindung des Zielproteins unter Verwendung eines Konjugats wie eines Antikörpers untersucht wird. Der Antikörper fluoresziert oder ändert seine Farbe, wodurch der Forscher die Aktivität der Enzyme bestimmen kann.