O que é um ensaio de ubiquitinação?
A ubiquitinação refere-se à ligação da proteína ubiquitina a outras proteínas por três enzimas diferentes. Um ensaio de ubiquitinação é um teste que determina quanto desse processo ocorre dentro da célula. Os testes podem ser usados para determinar como as diferentes condições afetam a ligação às proteínas, etapas e estruturas que são importantes na via da ubiquitinação e a quantidade de proteína na célula. Quantidades inadequadas ou superabundantes têm sido associadas ao desenvolvimento de muitas doenças diferentes.
Uma proteína encontrada nas células, a função da ubiquitina é se ligar a proteínas enquanto funciona como um "marcador" ou sinal para outras estruturas. Essa "etiqueta" sinaliza enzimas para saber que a proteína pode ser destruída, reciclada ou movida. O resultado é a destruição ou transporte de proteínas.
Essas proteínas de marcação são importantes para o reparo do DNA, infecções virais e resposta imune. Outras funções importantes incluem papéis na morte celular, divisão celular e desenvolvimento de células. Muita ubiquitina, ou falta dela, pode desempenhar um papel na formação de muitas doenças, como câncer, distúrbios genéticos e doenças do sistema imunológico.
Os pesquisadores usarão um ensaio de ubiquitinação para tentar determinar quais condições alteram a concentração da proteína na célula e comparando células doentes com células saudáveis. Os cientistas também o usam para investigar quais condições causarão alterações na vinculação. Além disso, eles podem tentar vincular código de DNA específico com a quantidade de enzimas na célula.
Há mais de um tipo de ensaio de ubiquitinação que os cientistas usam especificamente. Um determinará a porcentagem de proteínas que estão ligadas à ubiquintina. Outro examina a atividade de enzimas ou a presença de outros intermediários encontrados na via de ubiquinação. Diferentes ensaios são desenvolvidos com base na proteína alvo à qual a ubiquitina se ligará.
A base de um ensaio de ubiquitinação é incorporar um composto que é rotulado usando outro produto químico facilmente medido. Em ensaios oncológicos, a ubiquitina pode ser marcada com criptoato, um composto que contém dois átomos de nitrogênio. Isso pode ser usado para determinar qual enzima é mais ativa na célula.
Um ensaio de ubiquitinação terá duas etapas. O primeiro é um passo enzimático em que as enzimas ligam a ubiquitina marcada à proteína alvo. A segunda é uma etapa de detecção na qual a ligação da proteína alvo é examinada usando um conjugado como um anticorpo. O anticorpo irá fluorescir ou mudar de cor, o que permite ao pesquisador determinar a atividade das enzimas.