Was ist ein Northern Blot?
Northern-Blot-Hybridisierung ist eine Technik, die verwendet wird, um Messenger-RNA- (mRNA-) Spiegel in einer Probe zu detektieren und die Menge an vorhandener mRNA zu quantifizieren. Obwohl es andere leistungsstärkere Techniken gibt, bleibt der Northern Blot aufgrund seiner Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit der Standard. Die Northern-Blotting-Technik ermöglicht auch den direkten Vergleich mehrerer Proben in einem einzigen Experiment.
Messenger-RNA ist eine Art von Nukleinsäure, die bei der Expression eines Gens produziert wird. Ein Gen, das in einer Zelle eingeschaltet und funktionsfähig ist, wird in mRNA transkribiert. Die mRNA wird dann in das Zytoplasma der Zelle transportiert, wo sie in ein Protein übersetzt wird. Die Northern-Blot-Analyse einer zellulären mRNA-Probe kann daher nützliche Informationen über die Reihe von Proteinen liefern, die die Zelle produziert.
In einem Northern Blot wird mRNA aus Zellen extrahiert und durch eine denaturierende Agarosegelelektrophorese laufen gelassen, wodurch mRNA in der Probe nach Größe aufgetrennt werden kann. Proben von mRNA-Molekülen bekannter Größe werden gleichzeitig laufen gelassen, um eine Kontrolle bereitzustellen. Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, werden die Proben übertragen und auf einer festen Membran immobilisiert, die typischerweise aus einem Material wie Nylon hergestellt ist. Die Proben werden dann vor der Analyse mehrere Stunden lang radioaktiv markierten Sonden ausgesetzt. Während der Analyse kann mRNA, die an eine radioaktiv markierte Sonde hybridisiert ist, mit Röntgenstrahlen eindeutig nachgewiesen werden.
Die Northern-Blotting-Technik ermöglicht die Beobachtung von Genexpressionsmustern zwischen verschiedenen Gewebetypen. Messenger-RNA, die aus Zellen verschiedener Gewebe und Organtypen extrahiert wurde, kann verglichen werden, und es können zelluläre Reaktionen auf Stress, Infektion und viele andere Reize untersucht werden. Indem ein Wissenschaftler die Unterschiede in der mRNA-Expression unter verschiedenen Bedingungen untersucht, kann er bestimmen, welche Arten von Proteinen eine Zelle als Reaktion auf bestimmte Reize produziert. Dies kann Hinweise auf Funktionen unbekannter Proteine liefern, oder im Fall bekannter Proteine Informationen über zelluläre Reaktionen auf die fraglichen Stimuli.
Beispielsweise kann ein Northern Blot zeigen, dass die Expression eines unbekannten Proteins in Reaktion auf die Anwesenheit eines spezifischen Toxins zunimmt. Es könnte dann theoretisiert werden, dass das Protein an der Verringerung der Toxizität beteiligt ist, möglicherweise indem es die Chemikalie aus der Zelle transportiert oder sie in einen Metaboliten umwandelt. Wenn bekannte Proteine untersucht werden, kann die Dokumentation von Änderungen der Proteinexpression Aufschluss über die Reaktion selbst geben. Wenn beispielsweise die Expression eines bekannten molekularen Transporters erhöht wurde, konnte bestätigt werden, dass die zelluläre Antwort auf das Toxin darin besteht, das Toxin aus der Zelle heraus zu transportieren.