Hvad er en Northern Blot?
Northern blot hybridisering er en teknik, der anvendes til at detektere messenger RNA (mRNA) niveauer i en prøve og til at kvantificere mængden af mRNA, der er til stede. Selvom der findes andre mere kraftfulde teknikker, forbliver Northern blot standarden på grund af dens enkelhed og brugervenlighed. Den nordlige blotting-teknik muliggør også direkte sammenligning af flere prøver i et enkelt eksperiment.
Messenger RNA er en type nukleinsyre, der produceres, når et gen udtrykkes. Et gen, der er tændt og funktionelt i en celle, transkriberes til mRNA. MRNA transporteres derefter ind i cytoplasmaet i cellen, hvor det oversættes til et protein. Northern blot-analyse af en cellulær mRNA-prøve kan derfor tilvejebringe nyttig information om matrixen af proteiner, som cellen producerer.
I en nordlig blot ekstraheres mRNA fra celler og køres gennem en denaturerende agarosegelelektroforese, hvilket tillader mRNA i prøven at adskilles efter størrelse. Prøver af mRNA-molekyler med kendte størrelser køres på samme tid for at tilvejebringe en kontrol. Når elektroforese er afsluttet, overføres prøverne og immobiliseres på en fast membran, typisk fremstillet af et materiale, såsom nylon. Prøverne udsættes derefter for radiomærkede prober i adskillige timer før analyse. Under analysen kan mRNA, der er hybridiseret til en radiomærket sonde, detekteres klart ved hjælp af røntgen.
Den nordlige blotting-teknik muliggør observation af genekspressionsmønstre mellem forskellige vævstyper. Messenger RNA ekstraheret fra celler fra forskellige forskellige væv og organtyper kan sammenlignes, og cellulære reaktioner på stress, infektion og mange andre stimuli kan undersøges. Ved at se på forskelle i mRNA-ekspression under forskellige betingelser, kan en videnskabsmand bestemme, hvilke typer proteiner en celle producerer som respons på visse stimuli. Dette kan give ledetråde om funktioner af ukendte proteiner, eller i tilfælde af kendte proteiner, information om cellulære reaktioner på de aktuelle stimuli.
For eksempel kan en nordlig blot vise, at ekspressionen af et ukendt protein øges som respons på tilstedeværelsen af et specifikt toksin. Det kan derefter teoretiseres, at proteinet er involveret i reduktion af toksicitet, måske ved at transportere kemikaliet ud af cellen eller omdanne det til en metabolit. Hvis kendte proteiner er under undersøgelse, kan dokumentation af ændringer i proteinekspression give information om selve responsen. Hvis ekspressionen af en kendt molekylær transporter blev forøget, kunne det for eksempel bekræftes, at den cellulære respons på toksinet er at transportere toksinet ud af cellen.