O que é um Northern Blot?
A hibridação Northern blot é uma técnica usada para detectar níveis de RNA mensageiro (mRNA) em uma amostra e quantificar a quantidade de mRNA que está presente. Embora existam outras técnicas mais poderosas, o Northern Blot continua sendo o padrão devido à sua simplicidade e facilidade de uso. A técnica Northern Blotting também permite a comparação direta de várias amostras em um único experimento.
O RNA mensageiro é um tipo de ácido nucleico produzido quando um gene está sendo expresso. Um gene que é ativado e funcional dentro de uma célula é transcrito para o RNAm. O mRNA é então transportado para o citoplasma da célula, onde é traduzido em uma proteína. A análise de Northern blot de uma amostra de mRNA celular pode, portanto, fornecer informações úteis sobre a matriz de proteínas que a célula está produzindo.
Em uma mancha norte, o mRNA é extraído das células e executado através de uma eletroforese em gel de agarose desnaturante, que permite que o mRNA na amostra seja separado de acordo com o tamanho. Amostras de moléculas de mRNA de tamanhos conhecidos são executadas ao mesmo tempo para fornecer um controle. Após a eletroforese, as amostras são transferidas e imobilizadas em uma membrana sólida, normalmente feita de um material como o nylon. As amostras são então expostas a sondas radiomarcadas por várias horas antes da análise. Durante a análise, o mRNA que hibridou com uma sonda radiomarcada pode ser claramente detectado usando raios-x.
A técnica de Northern Blotting permite a observação de padrões de expressão gênica entre diferentes tipos de tecidos. O RNA mensageiro extraído de células de vários tecidos e tipos de órgãos diferentes pode ser comparado e as respostas celulares ao estresse, infecção e muitos outros estímulos podem ser examinadas. Observando as diferenças na expressão do mRNA sob diferentes condições, um cientista pode determinar que tipos de proteínas uma célula produz em resposta a determinados estímulos. Isso pode fornecer pistas sobre funções de proteínas desconhecidas ou, no caso de proteínas conhecidas, informações sobre respostas celulares aos estímulos em questão.
Por exemplo, uma mancha de Northern pode mostrar que a expressão de uma proteína desconhecida aumenta em resposta à presença de uma toxina específica. Poderia então ser teorizado que a proteína está envolvida na redução da toxicidade, talvez transportando o produto químico para fora da célula ou convertendo-o em um metabólito. Se proteínas conhecidas estiverem sendo examinadas, a documentação de alterações na expressão de proteínas pode fornecer informações sobre a resposta em si. Se a expressão de um transportador molecular conhecido fosse aumentada, por exemplo, poderia ser confirmado que a resposta celular à toxina é transportar a toxina para fora da célula.