¿Cuáles son los diferentes métodos de determinación de la concentración de proteínas?
Existen cientos de métodos diferentes de determinación de la concentración de proteínas. La increíble diversidad en los tipos de soluciones de proteínas que analizan los bioquímicos es la razón por la cual no existe un método universal único que funcione para cada tipo de solución de proteínas. Los ensayos de proteínas más comunes son el ensayo de Bradford, el ensayo de Lowry y el ensayo de ácido bicinconínico. Sin embargo, se han desarrollado innumerables variaciones según sea necesario para evitar posibles incompatibilidades químicas entre la solución de proteína y los reactivos que se utilizan en el ensayo.
En términos generales, hay dos categorías principales de ensayos para la determinación de la concentración de proteínas. En el primer grupo de métodos, se agrega un colorante colorido o fluorescente a una solución de proteína, y se une específicamente a la proteína. El tinte unido tiene una longitud de onda de absorción única que es proporcional a la cantidad de proteína. Al usar un espectrómetro, se hace posible estimar la concentración de proteína.
El segundo grupo de ensayos implica agregar iones de cobre (II) a una solución de proteína, donde estos iones se reducen a iones de cobre (I). Estos iones reducidos pueden formar complejos coloridos uniéndose a las proteínas. Al medir las absorbancias en sus longitudes de onda únicas, también se pueden inferir las concentraciones de proteínas.
Uno de los métodos más populares de determinación de la concentración de proteínas es el ensayo de Bradford. En este ensayo, se agrega un colorante rojo llamado azul brillante de coomassie a una solución de proteína en condiciones ácidas. A medida que este tinte se une a la proteína, forma un complejo azul permanente con una absorbancia característica a 595 nanómetros.
A pesar de la versatilidad general del ensayo de Bradford, es incompatible con algunas soluciones de proteínas. En particular, el ensayo de Bradford se ve interrumpido por la presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS), un detergente que se usa comúnmente para purificar proteínas y descomponer las células por lisis. Este detergente interfiere con la unión del colorante a las proteínas, lo que resulta en una lectura de absorción poco confiable e inexacta. Otros tipos de métodos, entonces, deben usarse cuando SDS está presente.
Se ha desarrollado otra serie de ensayos de proteínas, y todos implican una variación de la prueba de Biuret. En esta reacción, una proteína se combina con una base acuosa y iones de cobre (II). Estos iones son reducidos y luego quelados por proteínas para formar complejos coloridos. Dos ensayos que usan esta prueba son el ensayo de Lowry y el ensayo de ácido bicinconínico.
Con el ensayo Lowry, se agrega un reactivo Folin-Ciocalteu a la prueba de Biuret. El reactivo Folin-Ciocalteu oxida los residuos aromáticos, particularmente el triptófano, y ayuda al complejo a absorber fuertemente a 750 nanómetros. El ensayo de ácido bicinconínico, por otro lado, implica agregar ácido bicinconínico a la prueba de Biuret. Después de una breve incubación a aproximadamente 104 ° Fahrenheit (40 ° Celsius), dos equivalentes de ácido y los enlaces peptídicos de la proteína quelan un solo ion de cobre (I). El resultado es un complejo que absorbe fuertemente a 562 nanómetros.
Al seleccionar un método para la determinación de la concentración de proteínas, es importante tener en cuenta los diferentes grupos químicos funcionales presentes en la solución. La presencia de ciertas cadenas laterales de aminoácidos, enlaces disulfuro y cofactores puede hacer que la determinación de la concentración de proteína sea extremadamente inexacta. A menudo es necesario tener en cuenta no solo las proteínas sino también otros reactivos y tampones, como los agentes reductores y los detergentes. El método ideal será químicamente compatible, así como confiable, barato y fácil de configurar.