¿Cuáles son los diferentes métodos de determinación de concentración de proteínas?
Hay cientos de métodos diferentes de determinación de concentración de proteínas. La increíble diversidad en los tipos de soluciones de proteínas que analizan los bioquímicos es por qué no existe un solo método universal que funcione para cada tipo de solución de proteínas. Los ensayos de proteínas más comunes son el ensayo de Bradford, el ensayo Lowry y el ensayo de ácido bicinconínico. Sin embargo, se han desarrollado innumerables variaciones según sea necesario para trabajar en torno a cualquier posible incompatibilidad química entre la solución de proteínas y los reactivos que se utilizan en el ensayo.
En general, hay dos categorías principales de ensayos para la determinación de la concentración de proteínas. En el primer grupo de métodos, se agrega un colorido colorido o fluorescente a una solución de proteína, y se une específicamente a la proteína. El tinte unido tiene una longitud de onda de absorción única que es proporcional a la cantidad de proteína. Al usar un espectrómetro, es posible estimar la concentración de proteína.
el segundoEl grupo de ensayos implica agregar iones de cobre (II) a una solución de proteína, donde estos iones se reducen a iones de cobre (I). Estos iones reducidos pueden formar complejos coloridos uniéndose a las proteínas. Al medir las absorbancias en sus longitudes de onda únicas, las concentraciones de proteínas también se pueden inferir.
Uno de los métodos más populares de determinación de concentración de proteínas es el ensayo de Bradford. En este ensayo, se agrega un color rojo llamado azul brillante Coomassie a una solución de proteína en condiciones ácidas. Como este colorante se une a la proteína, forma un complejo azul permanente con una absorbancia característica en 595 nanómetros.
A pesar de la versatilidad general del ensayo de Bradford, es incompatible con algunas soluciones de proteínas. En particular, el ensayo de Bradford se ve interrumpido por la presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS), un detergente que se usa comúnmente para purificar proteínas y BREeak células por lisis. Este detergente interfiere con la unión del colorante a las proteínas, lo que da como resultado una lectura de absorción poco confiable e inexacta. Se deben usar otros tipos de métodos cuando SDS está presente.
Se ha desarrollado otra serie de ensayos de proteínas, y todos implican una variación de la prueba de biuret. En esta reacción, una proteína se combina con una base acuosa y iones de cobre (II). Estos iones se reducen y luego quelados por proteínas para formar complejos coloridos. Dos ensayos que usan esta prueba son el ensayo Lowry y el ensayo de ácido bicinconínico.
Con el ensayo Lowry, se agrega un reactivo Folin-Ciocalteu a la prueba de Biuret. El reactivo Folin-Ciocalteu oxida los residuos aromáticos, particularmente el triptófano, y ayuda al complejo a absorber fuertemente en 750 nanómetros. El ensayo de ácido bicinconínico, por otro lado, implica agregar ácido bicinconínico a la prueba de biuret. Después de una breve incubación a aproximadamente 104 ° Fahrenheit (40 ° Celsius), dos equivalentes deEl ácido y los enlaces péptidos de la proteína quelan un solo cobre (I) ion. El resultado es un complejo que absorbe fuertemente a 562 nanómetros.
Al seleccionar un método para la determinación de la concentración de proteínas, es importante que uno considere los diferentes grupos funcionales químicos presentes en la solución. La presencia de ciertas cadenas laterales de aminoácidos, enlaces disulfuro y cofactores puede hacer que la determinación de la concentración de proteína sea muy inexacta. A menudo es necesario que uno considere no solo las proteínas sino también otros reactivos y tampones, como la reducción de los agentes y los detergentes. El método ideal será químicamente compatible y será confiable, barato y simple de configurar.