Quelles sont les différentes méthodes de détermination de la concentration en protéines?
Il existe des centaines de méthodes différentes de détermination de la concentration en protéines. L'incroyable diversité des types de solutions protéiques analysées par les biochimistes explique pourquoi il n'existe pas de méthode universelle unique qui fonctionne pour tous les types de solutions protéiques. Les tests de protéines les plus courants sont le test de Bradford, le test de Lowry et le test d'acide bicinchoninique. Néanmoins, une myriade de variations ont été développées selon les besoins pour contourner d'éventuelles incompatibilités chimiques entre la solution de protéines et les réactifs utilisés dans le test.
De manière générale, il existe deux grandes catégories d'essais pour la détermination de la concentration en protéines. Dans le premier groupe de méthodes, un colorant coloré ou fluorescent est ajouté à une solution protéique et se lie spécifiquement à la protéine. Le colorant lié a une longueur d'onde d'absorption unique, proportionnelle à la quantité de protéine. En utilisant un spectromètre, il devient possible d'estimer la concentration de protéines.
Le deuxième groupe d’analyses consiste à ajouter des ions cuivre (II) à une solution de protéines, où ces ions sont réduits en ions cuivre (I). Ces ions réduits sont alors capables de former des complexes colorés en se liant à des protéines. En mesurant les absorbances à leurs longueurs d'onde uniques, on peut également déduire les concentrations en protéines.
L'une des méthodes les plus populaires de détermination de la concentration en protéines est le test de Bradford. Dans cet essai, un colorant rouge appelé bleu brillant coomassie est ajouté à une solution de protéines dans des conditions acides. Comme ce colorant se lie à une protéine, il forme un complexe bleu permanent avec une absorbance caractéristique à 595 nanomètres.
Malgré la polyvalence générale du test Bradford, il est incompatible avec certaines solutions protéiques. En particulier, le test de Bradford est perturbé par la présence de sodium dodécyl sulfate (SDS), un détergent couramment utilisé pour purifier les protéines et décomposer les cellules par lyse. Ce détergent interfère avec la liaison du colorant aux protéines, ce qui entraîne une lecture d'absorption peu fiable et imprécise. Il faut donc utiliser d'autres types de méthodes en présence de SDS.
Une autre série d’analyses protéiques a été mise au point et toutes impliquent une variante du test Biuret. Dans cette réaction, une protéine est combinée à une base aqueuse et à des ions cuivre (II). Ces ions sont réduits puis chélatés par des protéines pour former des complexes colorés. Deux tests qui utilisent ce test sont le test de Lowry et le test d'acide bicinchoninique.
Avec le test de Lowry, un réactif de Folin-Ciocalteu est ajouté au test Biuret. Le réactif Folin-Ciocalteu oxyde les résidus aromatiques, en particulier le tryptophane, et aide le complexe à absorber fortement à 750 nanomètres. Le dosage de l'acide bicinchoninique, d'autre part, implique l'ajout d'acide bicinchoninique au test Biuret. Après une brève incubation à environ 40 ° C, deux équivalents d'acide et les liaisons peptidiques de la protéine chélatent un seul ion de cuivre (I). Le résultat est un complexe qui absorbe fortement à 562 nanomètres.
Lors du choix d'une méthode de détermination de la concentration en protéines, il est important de prendre en compte les différents groupes fonctionnels chimiques présents dans la solution. La présence de certaines chaînes latérales d'acides aminés, de liaisons disulfure et de cofacteurs peut rendre la détermination de la concentration en protéines extrêmement imprécise. Il est souvent nécessaire de prendre en compte non seulement les protéines mais également d'autres réactifs et tampons, tels que des agents réducteurs et des détergents. La méthode idéale sera chimiquement compatible, fiable, peu coûteuse et simple à mettre en place.