Wat zijn de verschillende methoden voor het bepalen van de eiwitconcentratie?
Er zijn honderden verschillende methoden voor het bepalen van de eiwitconcentratie. De ongelooflijke diversiteit in de soorten eiwitoplossingen die biochemici analyseren, is waarom er geen enkele universele methode is die voor elk type eiwitoplossing werkt. De meest voorkomende eiwittesten zijn de Bradford-test, de Lowry-test en de bicinchoninezuur-test. Desondanks zijn er talloze variaties ontwikkeld die nodig zijn om mogelijke chemische incompatibiliteit tussen de eiwitoplossing en de reagentia die in de test worden gebruikt, te omzeilen.
Over het algemeen zijn er twee hoofdcategorieën van bepalingen voor bepaling van de eiwitconcentratie. In de eerste groep methoden wordt een kleurrijke of fluorescerende kleurstof aan een eiwitoplossing toegevoegd en deze bindt zich specifiek aan eiwit. De gebonden kleurstof heeft een unieke absorptiegolflengte die evenredig is met de hoeveelheid eiwit. Door een spectrometer te gebruiken, wordt het mogelijk om de eiwitconcentratie te schatten.
De tweede groep testen omvat het toevoegen van koper (II) ionen aan een oplossing van eiwit, waar deze ionen worden gereduceerd tot koper (I) ionen. Deze gereduceerde ionen kunnen vervolgens kleurrijke complexen vormen door zich te binden aan eiwitten. Door de absorpties op hun unieke golflengtes te meten, kunnen de eiwitconcentraties eveneens worden afgeleid.
Een van de meest populaire methoden voor het bepalen van de eiwitconcentratie is de Bradford-test. In deze test wordt een rode kleurstof genaamd coomassie brilliant blue toegevoegd aan een eiwitoplossing onder zure omstandigheden. Omdat deze kleurstof aan eiwitten bindt, vormt het een permanent blauw complex met een karakteristieke absorptie bij 595 nanometer.
Ondanks de algemene veelzijdigheid van de Bradford-test, is deze niet compatibel met sommige eiwitoplossingen. In het bijzonder wordt de Bradford-test verstoord door de aanwezigheid van natriumdodecylsulfaat (SDS), een detergens dat gewoonlijk wordt gebruikt om eiwitten te zuiveren en cellen af te breken door lysis. Dit wasmiddel interfereert met de binding van de kleurstof aan eiwitten, wat resulteert in een onbetrouwbare en onnauwkeurige absorptiewaarde. Er moeten dus andere soorten methoden worden gebruikt wanneer SDS aanwezig is.
Er is nog een reeks eiwittests ontwikkeld die allemaal een variatie op de Biuret-test inhouden. Bij deze reactie wordt een eiwit gecombineerd met een waterige base en koper (II) ionen. Deze ionen worden gereduceerd en vervolgens gechelateerd door eiwit om kleurrijke complexen te vormen. Twee testen die deze test gebruiken zijn de Lowry-test en de bicinchoninezuur-test.
Met de Lowry-test wordt een Folin-Ciocalteu-reagens aan de Biuret-test toegevoegd. Het Folin-Ciocalteu-reagens oxideert aromatische residuen, met name tryptofaan, en helpt het complex sterk te absorberen bij 750 nanometer. De bicinchoninezuurbepaling omvat anderzijds het toevoegen van bicinchoninezuur aan de Biuret-test. Na een korte incubatie bij ongeveer 104 ° Fahrenheit (40 ° Celsius) cheleren twee equivalenten zuur en de peptidebindingen van het eiwit een enkel koper (I) ion. Het resultaat is een complex dat sterk absorbeert bij 562 nanometer.
Bij het kiezen van een methode voor het bepalen van de eiwitconcentratie, is het belangrijk om rekening te houden met de verschillende chemische functionele groepen die in de oplossing aanwezig zijn. De aanwezigheid van bepaalde zijketens van aminozuren, disulfidebindingen en co-factoren kunnen de bepaling van de eiwitconcentratie wild onnauwkeurig maken. Het is vaak noodzakelijk om niet alleen de eiwitten te overwegen, maar ook andere reagentia en buffers, zoals reductiemiddelen en wasmiddelen. De ideale methode is chemisch compatibel en betrouwbaar, goedkoop en eenvoudig in te stellen.