Wat zijn de verschillende methoden voor bepaling van eiwitconcentratie?
Er zijn honderden verschillende methoden voor bepaling van eiwitconcentratie. De ongelooflijke diversiteit in de soorten eiwitoplossingen die biochemisten analyseren, is waarom er geen enkele universele methode is die werkt voor elk type eiwitoplossing. De meest voorkomende eiwitassays zijn de Bradford -test, de lowry -test en de bicinchoninezuurbepaling. Desalniettemin zijn talloze variaties ontwikkeld als dat nodig is om potentiële chemische incompatibiliteit tussen de eiwitoplossing en de reagentia te omzeilen die in de test worden gebruikt. In de eerste groep methoden wordt een kleurrijke of fluorescerende kleurstof toegevoegd aan een eiwitoplossing en bindt deze specifiek aan eiwitten. De gebonden kleurstof heeft een unieke absorptiegolflengte die evenredig is met de hoeveelheid eiwit. Door een spectrometer te gebruiken, wordt het mogelijk om de eiwitconcentratie te schatten.
het tweedeGroep testen omvat het toevoegen van koper (II) ionen aan een oplossing van eiwitten, waarbij deze ionen worden gereduceerd tot koperen (I) ionen. Deze verminderde ionen zijn vervolgens in staat om kleurrijke complexen te vormen door te binden aan eiwitten. Door de absorpties op hun unieke golflengten te meten, kunnen de eiwitconcentraties ook worden afgeleid.
Een van de meest populaire methoden voor bepaling van eiwitconcentratie is de Bradford -test. In deze test wordt een rode kleurstof genaamd Coomassie Brilliant Blue toegevoegd aan een eiwitoplossing onder zure omstandigheden. Terwijl deze kleurstof bindt aan eiwit, vormt het een permanent blauw complex met een karakteristieke absorptie bij 595 nanometer.
Ondanks de algemene veelzijdigheid van de Bradford -test, is deze onverenigbaar met sommige eiwitoplossingen. In het bijzonder wordt de Bradford -test verstoord door de aanwezigheid van natriumdodecylsulfaat (SDS), een wasmiddel dat vaak wordt gebruikt om eiwitten en br te zuiverenEak cellen naar beneden door lysis. Dit wasmiddel interfereert met de binding van de kleurstof aan eiwitten, wat resulteert in een onbetrouwbare en onnauwkeurige absorptie -lezing. Andere soorten methoden moeten dus worden gebruikt wanneer SDS aanwezig is.
Er is nog een reeks eiwitassays ontwikkeld en ze omvatten allemaal een variatie van de biuret -test. In deze reactie wordt een eiwit gecombineerd met een waterige basis en koper (II) ionen. Deze ionen worden verminderd en vervolgens gechelateerd door eiwit om kleurrijke complexen te vormen. Twee testen die deze test gebruiken, zijn de lowry -test en de bicinchoninezuurbepaling.
Met de lowry-test wordt een folin-ciocalteu-reagens toegevoegd aan de biuret-test. Het foline-ciocalteu-reagens oxideert aromatische residuen, met name tryptofaan, en helpt het complex sterk te absorberen bij 750 nanometers. De bicinchoninezuurstest daarentegen omvat het toevoegen van bicinchoninezuur aan de biuret -test. Na een korte incubatie bij ongeveer 104 ° Fahrenheit (40 ° Celsius), twee equivalenten vanZuur en de peptidebindingen van het eiwitchelaat een enkel koper (I) ion. Het resultaat is een complex dat sterk absorbeert bij 562 nanometer.
Bij het selecteren van een methode voor bepaling van eiwitconcentratie is het belangrijk dat iemand rekening houdt met de verschillende chemische functionele groepen die in de oplossing aanwezig zijn. De aanwezigheid van bepaalde aminozuurzijketens, disulfidebindingen en cofactoren kan de eiwitconcentratiebepaling wild onnauwkeurig maken. Het is vaak nodig dat iemand niet alleen de eiwitten, maar ook andere reagentia en buffers, zoals reducerende middelen en wasmiddelen overwegen. De ideale methode is chemisch compatibel en zijn betrouwbaar, goedkoop en eenvoudig in te stellen.