Hva er de forskjellige metodene for bestemmelse av proteinkonsentrasjon?
Det er hundrevis av forskjellige metoder for bestemmelse av proteinkonsentrasjon. Det utrolige mangfoldet i de typene proteinløsninger som biokjemikere analyserer, er grunnen til at det ikke er en eneste universell metode som fungerer for hver type proteinløsning. De vanligste proteinanalysene er Bradford-analysen, Lowry-analysen og bicinchoninsyre-analysen. Likevel er det utviklet utallige variasjoner etter behov for å omgå potensielle kjemiske inkompatibiliteter mellom proteinløsningen og reagensene som blir brukt i analysen.
Generelt sett er det to hovedkategorier av analyser for bestemmelse av proteinkonsentrasjon. I den første metodegruppen tilsettes en fargerik eller fluoriserende fargestoff til en proteinløsning, og den binder seg spesielt til protein. Det bundne fargestoffet har en unik absorpsjonsbølgelengde som er proporsjonal med mengden protein. Ved å bruke et spektrometer blir det mulig å estimere konsentrasjonen av protein.
Den andre gruppen av analyser involverer tilsetning av kobber (II) -ioner til en proteinløsning, hvor disse ionene er redusert til kobber (I) -ioner. Disse reduserte ionene er da i stand til å danne fargerike komplekser ved å binde seg til proteiner. Ved å måle absorbansene på deres unike bølgelengder, kan proteinkonsentrasjonene på samme måte utledes.
En av de mest populære metodene for bestemmelse av proteinkonsentrasjon er Bradford-analysen. I denne analysen tilsettes et rødt fargestoff kalt coomassie briljantblått til en proteinløsning under sure forhold. Da dette fargestoffet binder seg til protein, danner det et permanent blått kompleks med en karakteristisk absorbans ved 595 nanometer.
Til tross for den generelle allsidigheten til Bradford-analysen, er den uforenlig med noen proteinløsninger. Spesielt blir Bradford-analysen forstyrret av tilstedeværelsen av natriumdodecylsulfat (SDS), et vaskemiddel som vanligvis brukes til å rense proteiner og bryte ned celler ved lysering. Dette vaskemidlet forstyrrer bindingen av fargestoffet til proteiner, noe som resulterer i en upålitelig og unøyaktig absorpsjonsavlesning. Andre typer metoder må da brukes når SDS er til stede.
En annen serie proteinanalyser er utviklet, og de involverer alle en variant av Biuret-testen. I denne reaksjonen blir et protein kombinert med en vandig base og kobber (II) -ioner. Disse ionene reduseres og cheleres deretter med protein for å danne fargerike komplekser. To analyser som bruker denne testen er Lowry-analysen og bicinchoninsyre-analysen.
Med Lowry-analysen tilsettes et Folin-Ciocalteu-reagens til Biuret-testen. Folin-Ciocalteu-reagenset oksiderer aromatiske rester, spesielt tryptofan, og hjelper komplekset til å absorbere sterkt ved 750 nanometer. Bicinchoninsyre-analyse, derimot, innebærer å tilsette bicinchoninsyre til Biuret-testen. Etter en kort inkubering ved ca. 104 ° F, kelaterte to ekvivalenter syre og peptidbindingen til proteinet et enkelt kobber (I) ion. Resultatet er et kompleks som absorberer seg sterkt ved 562 nanometer.
Når du velger en metode for bestemmelse av proteinkonsentrasjon, er det viktig for en å vurdere de forskjellige kjemiske funksjonelle gruppene som er til stede i løsningen. Tilstedeværelsen av visse aminosyresidekjeder, disulfidbindinger og kofaktorer kan gjøre bestemmelse av proteinkonsentrasjon vilt unøyaktig. Det er ofte nødvendig for en å ikke bare vurdere proteiner, men også andre reagenser og buffere, som reduksjonsmidler og vaskemidler. Den ideelle metoden vil være kjemisk kompatibel samt være pålitelig, billig og enkel å sette opp.