Jakie są różne metody oznaczania stężenia białka?
Istnieją setki różnych metod oznaczania stężenia białka. Niesamowita różnorodność rodzajów roztworów białek analizowanych przez biochemików sprawia, że nie ma jednej uniwersalnej metody, która działałaby dla każdego rodzaju roztworu białek. Najczęstsze testy białkowe to test Bradforda, test Lowry'ego i test kwasu bicynchoninowego. Niemniej jednak opracowano niezliczone warianty, aby obejść wszelkie potencjalne niezgodności chemiczne między roztworem białka i odczynnikami stosowanymi w teście.
Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwie główne kategorie testów do oznaczania stężenia białka. W pierwszej grupie metod barwiony lub fluorescencyjny barwnik jest dodawany do roztworu białka i wiąże się specyficznie z białkiem. Związany barwnik ma unikalną długość fali absorpcji, która jest proporcjonalna do ilości białka. Za pomocą spektrometru staje się możliwe oszacowanie stężenia białka.
Druga grupa testów obejmuje dodanie jonów miedzi (II) do roztworu białka, w którym jony te są redukowane do jonów miedzi (I). Te zredukowane jony mogą następnie tworzyć kolorowe kompleksy przez wiązanie z białkami. Poprzez pomiar absorbancji przy ich unikalnych długościach fal można również wnioskować o stężeniach białka.
Jedną z najpopularniejszych metod oznaczania stężenia białka jest test Bradforda. W tym teście czerwony roztwór zwany błękitem brylantowym Coomassie dodaje się do roztworu białka w warunkach kwasowych. Gdy ten barwnik wiąże się z białkiem, tworzy trwały niebieski kompleks o charakterystycznej absorbancji przy 595 nanometrach.
Pomimo ogólnej wszechstronności testu Bradforda, jest on niezgodny z niektórymi roztworami białka. W szczególności test Bradforda jest zakłócany przez obecność dodecylosiarczanu sodu (SDS), detergentu, który jest powszechnie stosowany do oczyszczania białek i rozkładania komórek przez lizę. Ten detergent zakłóca wiązanie barwnika z białkami, co powoduje niewiarygodny i niedokładny odczyt absorpcji. W przypadku obecności SDS należy zastosować inne rodzaje metod.
Opracowano kolejną serię testów białkowych, z których wszystkie obejmują odmianę testu Biuret. W tej reakcji białko łączy się z wodną zasadą i jonami miedzi (II). Jony te są redukowane, a następnie chelatowane przez białko, tworząc kolorowe kompleksy. Dwa testy wykorzystujące ten test to test Lowry'ego i test kwasu bicynchoninowego.
W teście Lowry'ego do testu Biuret dodawany jest odczynnik Folina-Ciocalteu. Odczynnik Folin-Ciocalteu utlenia pozostałości aromatyczne, szczególnie tryptofan, i pomaga kompleksowi silnie wchłonąć przy 750 nanometrach. Z drugiej strony, test kwasu bicynchoninowego obejmuje dodanie kwasu bicynchoninowego do testu Biuret. Po krótkiej inkubacji w temperaturze około 104 ° Fahrenheita (40 ° Celsjusza) dwa równoważniki kwasu i wiązania peptydowe białka chelatują pojedynczy jon miedzi (I). Rezultatem jest kompleks, który silnie absorbuje przy 562 nanometrach.
Przy wyborze metody oznaczania stężenia białka ważne jest, aby wziąć pod uwagę różne chemiczne grupy funkcyjne obecne w roztworze. Obecność niektórych łańcuchów bocznych aminokwasów, wiązań dwusiarczkowych i kofaktorów może sprawić, że określenie stężenia białka będzie bardzo niedokładne. Często trzeba wziąć pod uwagę nie tylko białka, ale także inne odczynniki i bufory, takie jak środki redukujące i detergenty. Idealna metoda będzie kompatybilna chemicznie, a także niezawodna, tania i prosta w konfiguracji.