Jakie są różne metody oznaczania stężenia białka?
Istnieją setki różnych metod oznaczania stężenia białka. Niesamowita różnorodność rodzajów roztworów białkowych, które analizują biochemicy, jest to, dlaczego nie ma pojedynczej uniwersalnej metody, która działa dla każdego rodzaju roztworu białkowego. Najczęstszymi testami białkowymi są test Bradforda, test Lowry i test kwasu bicynchoninowego. Niemniej jednak niezliczone zmiany zostały opracowane w razie potrzeby, aby obejść wszelkie potencjalne niekompatybilności chemiczne między roztworem białkowym a odczynnikami, które są stosowane w teście.
Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwie główne kategorie testów do oznaczania stężenia białka. W pierwszej grupie metod do roztworu białka dodaje się kolorowy lub fluorescencyjny barwnik i wiąże się ono z białkiem. Związany barwnik ma unikalną długość fali absorpcji, która jest proporcjonalna do ilości białka. Za pomocą spektrometru staje się możliwe oszacowanie stężenia białka.
drugiGrupa testów obejmuje dodanie jonów miedzi (II) do roztworu białka, w którym jony te są redukowane do jonów miedzi (i). Te zredukowane jony są w stanie tworzyć kolorowe kompleksy poprzez wiązanie z białkami. Mierzenie absorbancji przy ich unikalnych długościach fali można również wywnioskować stężenie białka.
Jedną z najpopularniejszych metod oznaczania stężenia białka jest test Bradford. W tym teście czerwony barwnik zwany genialnym niebieskim Coomassie jest dodawany do roztworu białkowego w warunkach kwaśnych. Gdy ten barwnik wiąże się z białkiem, tworzy stały niebieski kompleks z charakterystyczną absorbancją przy 595 nanometrach.
Pomimo ogólnej wszechstronności testu Bradforda, jest on niezgodny z niektórymi roztworami białkowymi. W szczególności test Bradforda jest zakłócany przez obecność dodecylulfinianu sodu (SDS), detergentu powszechnie stosowanego do oczyszczania białek i BRaak w dół komórek przez lizę. Ten detergent zakłóca wiązanie barwnika z białkami, co powoduje niewiarygodne i niedokładne odczyt wchłaniania. Inne rodzaje metod należy zatem zastosować, gdy występuje SDS.
Opracowano kolejną serię testów białkowych i wszystkie obejmują one zmianę testu biuretu. W tej reakcji białko łączy się z wodną podstawą i jonami miedzi (II). Jony te są zmniejszone, a następnie chelowane przez białko, tworząc kolorowe kompleksy. Dwa testy, które używają tego testu, to test Lowry i test kwasu bicynchoninowego.
Za pomocą testu Lowry do testu biuretu dodaje się odczynnik folin-ciocalteu. Odczynnik odczynnika folin-ciocalteu utlenia reszty aromatyczne, szczególnie tryptofan, i pomaga kompleks silnie wchłania się przy 750 nanometrach. Z drugiej strony test kwasu bicynchoninowego polega na dodaniu kwasu bicynchoninowego do testu biuretu. Po krótkiej inkubacji przy około 104 ° Fahrenheita (40 ° Celsjusza), dwa odpowiednikiwiązania kwasu i peptydu białka chelatują pojedynczą miedź (i) jon. Rezultatem jest kompleks, który silnie pochłania się przy 562 nanometrach.
Przy wyborze metody oznaczania stężenia białka ważne jest, aby wziąć pod uwagę różne grupy funkcjonalne chemiczne obecne w roztworze. Obecność niektórych łańcuchów bocznych aminokwasów, wiązań disiarczkowych i kofaktorów może sprawić, że oznaczanie stężenia białka są niezwykle niedokładne. Często konieczne jest rozważenie nie tylko białek, ale także innych odczynników i buforów, takich jak zmniejszenie środków i detergentów. Idealna metoda będzie chemicznie kompatybilna, a także będzie niezawodna, tania i prosta w konfiguracji.