Vilka är de olika metoderna för bestämning av proteinkoncentration?
Det finns hundratals olika metoder för att bestämma proteinkoncentration. Den otroliga mångfalden i de typer av proteinlösningar som biokemister analyserar är varför det inte finns en enda universell metod som fungerar för varje typ av proteinlösning. De vanligaste proteinanalyserna är Bradford-analysen, Lowry-analysen och bicinchoninsyraanalysen. Ändå har otaliga variationer utvecklats efter behov för att hantera eventuella kemiska oförenligheter mellan proteinlösningen och reagensen som används i analysen.
Generellt sett finns det två huvudkategorier av analyser för bestämning av proteinkoncentration. I den första metodgruppen läggs ett färgstarkt eller fluorescerande färgämne till en proteinlösning, och den binder specifikt till protein. Det bundna färgämnet har en unik absorptionsvåglängd som är proportionell mot mängden protein. Genom att använda en spektrometer blir det möjligt att uppskatta koncentrationen av protein.
Den andra gruppen analyser involverar tillsats av koppar (II) joner till en proteinlösning, där dessa joner reduceras till koppar (I) joner. Dessa reducerade joner kan sedan bilda färgglada komplex genom att binda till proteiner. Genom att mäta absorbanserna på deras unika våglängder kan proteinkoncentrationerna på liknande sätt dras.
En av de mest populära metoderna för bestämning av proteinkoncentration är Bradford-analysen. I denna analys tillsätts ett rött färgämne som kallas coomassie briljantblått till en proteinlösning under sura förhållanden. Eftersom detta färgämne binder till protein, bildar det ett permanent blått komplex med en karakteristisk absorbans vid 595 nanometer.
Trots den allmänna mångsidigheten i Bradford-analysen är den oförenlig med vissa proteinlösningar. I synnerhet störs Bradford-analysen av närvaron av natriumdodecylsulfat (SDS), ett tvättmedel som vanligtvis används för att rena proteiner och bryta ned celler genom lys. Detta rengöringsmedel stör störningen av färgämnet till proteiner, vilket resulterar i en opålitlig och felaktig absorptionsavläsning. Andra typer av metoder måste då användas när SDS är närvarande.
En annan serie proteinanalyser har utvecklats och de involverar alla en variation av Biuret-testet. I denna reaktion kombineras ett protein med en vattenhaltig bas och koppar (II) joner. Dessa joner reduceras och kelateras sedan med protein för att bilda färgglada komplex. Två analyser som använder detta test är Lowry-analysen och bicinchoninsyraanalysen.
Med Lowry-analysen tillsätts ett Folin-Ciocalteu-reagens till Biuret-testet. Folin-Ciocalteu-reagenset oxiderar aromatiska rester, särskilt tryptofan, och hjälper komplexet att absorbera starkt vid 750 nanometer. Bicinchoninsyraanalysen å andra sidan innebär tillsats av bikinchoninsyra till Biuret-testet. Efter en kort inkubation vid cirka 104 ° Fahrenheit (40 ° Celsius), två ekvivalenter syra och peptidbindningarna i proteinet kelat en enda koppar (I) jon. Resultatet är ett komplex som absorberar starkt vid 562 nanometer.
När man väljer en metod för bestämning av proteinkoncentration är det viktigt för en att beakta de olika kemiska funktionella grupperna som finns i lösningen. Närvaron av vissa aminosyrasidokedjor, disulfidbindningar och kofaktorer kan göra att proteinkoncentrationsbestämningen valt felaktig. Det är ofta nödvändigt för en att inte bara överväga proteiner utan även andra reagens och buffertar, såsom reduktionsmedel och detergenter. Den ideala metoden kommer att vara kemiskt kompatibel samt vara pålitlig, billig och enkel att installera.