Quais são os diferentes métodos de determinação da concentração de proteínas?

Existem centenas de diferentes métodos de determinação da concentração de proteínas. A incrível diversidade nos tipos de soluções de proteínas que os bioquímicos analisam é por que não existe um método universal único que funcione para todo tipo de solução de proteína. Os ensaios de proteína mais comuns são o ensaio de Bradford, o ensaio de Lowry e o ensaio de ácido bicinchonínico. No entanto, inúmeras variações foram desenvolvidas conforme necessário para contornar qualquer incompatibilidade química potencial entre a solução proteica e os reagentes que estão sendo usados ​​no ensaio.

Em geral, existem duas categorias principais de ensaios para determinação da concentração de proteínas. No primeiro grupo de métodos, um corante colorido ou fluorescente é adicionado a uma solução de proteína e se liga especificamente à proteína. O corante ligado possui um comprimento de onda de absorção único que é proporcional à quantidade de proteína. Usando um espectrômetro, torna -se possível estimar a concentração de proteína.

o segundoO grupo de ensaios envolve a adição de íons de cobre (II) a uma solução de proteína, onde esses íons são reduzidos a íons de cobre (i). Esses íons reduzidos são então capazes de formar complexos coloridos, ligando -se a proteínas. Ao medir as absorvâncias em seus comprimentos de onda exclusivos, as concentrações de proteína também podem ser inferidas.

Um dos métodos mais populares de determinação da concentração de proteínas é o ensaio de Bradford. Neste ensaio, um corante vermelho chamado coomassie brilhante azul é adicionado a uma solução proteica em condições ácidas. À medida que esse corante se liga à proteína, forma um complexo azul permanente com uma absorvância característica em 595 nanômetros.

Apesar da versatilidade geral do ensaio de Bradford, é incompatível com algumas soluções de proteínas. Em particular, o ensaio de Bradford é interrompido pela presença de dodecilsulfato de sódio (SDS), um detergente que é comumente usado para purificar proteínas e BRAs células descendentes por lise. Esse detergente interfere na ligação do corante às proteínas, o que resulta em uma leitura de absorção não confiável e imprecisa. Outros tipos de métodos, então, devem ser usados ​​quando o SDS estiver presente.

Outra série de ensaios de proteína foi desenvolvida e todos envolvem uma variação do teste de biureto. Nesta reação, uma proteína é combinada com uma base aquosa e íons de cobre (II). Esses íons são reduzidos e depois quelados pela proteína para formar complexos coloridos. Dois ensaios que usam este teste são o ensaio Lowry e o ensaio de ácido bicinchonínico.

Com o ensaio Lowry, um reagente Folin-Ciocalteu é adicionado ao teste de biureto. O reagente de Folin-Ciocalteu oxida os resíduos aromáticos, particularmente o triptofano, e ajuda o complexo a absorver fortemente em 750 nanômetros. O ensaio de ácido bicinchonínico, por outro lado, envolve a adição de ácido bicinchonínico ao teste de biureto. Após uma breve incubação a cerca de 104 ° Fahrenheit (40 ° Celsius), dois equivalentes deAs ligações ácidas e peptídicas da proteína quelam um único íon de cobre (i). O resultado é um complexo que absorve fortemente em 562 nanômetros.

Ao selecionar um método para determinação da concentração de proteínas, é importante considerar os diferentes grupos funcionais químicos presentes na solução. A presença de certas cadeias laterais de aminoácidos, ligações dissulfeto e cofatores pode tornar a determinação da concentração de proteínas muito imprecisa. Muitas vezes, é necessário considerar não apenas as proteínas, mas também outros reagentes e tampões, como redução de agentes e detergentes. O método ideal será quimicamente compatível e como confiável, barato e simples de configurar.