Quais são os diferentes métodos de determinação da concentração de proteínas?

Existem centenas de métodos diferentes de determinação da concentração de proteínas. A incrível diversidade nos tipos de soluções de proteínas analisadas pelos bioquímicos é o motivo pelo qual não existe um método universal único que funcione para todos os tipos de soluções de proteínas. Os ensaios de proteínas mais comuns são o ensaio de Bradford, o ensaio de Lowry e o ensaio com ácido bicinconínico. No entanto, inúmeras variações foram desenvolvidas conforme necessário para solucionar possíveis incompatibilidades químicas entre a solução proteica e os reagentes que estão sendo utilizados no ensaio.

De um modo geral, existem duas categorias principais de ensaios para determinação da concentração de proteínas. No primeiro grupo de métodos, um corante colorido ou fluorescente é adicionado a uma solução de proteína e se liga especificamente à proteína. O corante ligado tem um comprimento de onda de absorção único, proporcional à quantidade de proteína. Usando um espectrômetro, torna-se possível estimar a concentração de proteína.

O segundo grupo de ensaios envolve a adição de íons cobre (II) a uma solução de proteína, onde esses íons são reduzidos a íons cobre (I). Esses íons reduzidos são capazes de formar complexos coloridos ligando-se a proteínas. Medindo as absorvâncias em seus comprimentos de onda únicos, as concentrações de proteínas também podem ser inferidas.

Um dos métodos mais populares de determinação da concentração de proteínas é o ensaio de Bradford. Neste ensaio, um corante vermelho chamado azul brilhante de coomassie é adicionado a uma solução de proteína em condições ácidas. Como esse corante se liga à proteína, forma um complexo azul permanente com absorvância característica a 595 nanômetros.

Apesar da versatilidade geral do ensaio Bradford, é incompatível com algumas soluções de proteínas. Em particular, o ensaio de Bradford é interrompido pela presença de dodecilsulfato de sódio (SDS), um detergente comumente usado para purificar proteínas e quebrar células por lise. Esse detergente interfere na ligação do corante às proteínas, o que resulta em uma leitura de absorção não confiável e imprecisa. Outros tipos de métodos, portanto, devem ser usados ​​quando o SDS estiver presente.

Outra série de ensaios de proteínas foi desenvolvida e todos eles envolvem uma variação do teste Biuret. Nesta reação, uma proteína é combinada com uma base aquosa e íons cobre (II). Esses íons são reduzidos e depois quelatados por proteínas para formar complexos coloridos. Dois ensaios que utilizam este teste são o ensaio de Lowry e o ensaio do ácido bicinconínico.

Com o ensaio Lowry, um reagente de Folin-Ciocalteu é adicionado ao teste de Biuret. O reagente Folin-Ciocalteu oxida resíduos aromáticos, particularmente triptofano, e ajuda o complexo a absorver fortemente a 750 nanômetros. O ensaio com ácido bicinconínico, por outro lado, envolve a adição de ácido bicinconínico ao teste de Biuret. Após uma breve incubação a cerca de 40 ° Celsius (104 ° Fahrenheit), dois equivalentes de ácido e as ligações peptídicas da proteína quelam um único íon cobre (I). O resultado é um complexo que absorve fortemente a 562 nanômetros.

Ao selecionar um método para determinação da concentração de proteínas, é importante considerar os diferentes grupos funcionais químicos presentes na solução. A presença de certas cadeias laterais de aminoácidos, ligações dissulfeto e cofatores pode tornar imprecisa a determinação da concentração de proteínas. Muitas vezes é necessário considerar não apenas as proteínas, mas também outros reagentes e tampões, como agentes redutores e detergentes. O método ideal será quimicamente compatível, além de confiável, barato e simples de configurar.