Hvad er de forskellige metoder til bestemmelse af proteinkoncentration?
Der er hundreder af forskellige metoder til bestemmelse af proteinkoncentration. Den utrolige mangfoldighed i de typer proteinopløsninger, som biokemikere analyserer, er grunden til, at der ikke er en enkelt universel metode, der fungerer til enhver type proteinopløsning. De mest almindelige proteinassays er Bradford-assayet, Lowry-assayet og bicinchoninsyreassayet. Ikke desto mindre er der udviklet adskillige variationer efter behov for at omgå enhver potentiel kemisk inkompatibilitet mellem proteinopløsningen og de reagenser, der anvendes i analysen.
Generelt er der to hovedkategorier af assays til bestemmelse af proteinkoncentration. I den første gruppe af metoder tilsættes et farverigt eller fluorescerende farvestof til en proteinopløsning, og den binder specifikt til protein. Det bundne farvestof har en unik absorptionsbølgelængde, der er proportional med mængden af protein. Ved at bruge et spektrometer bliver det muligt at estimere proteinkoncentrationen.
Den anden gruppe af assays involverer tilsætning af kobber (II) -ioner til en proteinopløsning, hvor disse ioner reduceres til kobber (I) -ioner. Disse reducerede ioner er derefter i stand til at danne farverige komplekser ved at binde til proteiner. Ved at måle absorbanserne på deres unikke bølgelængder kan proteinkoncentrationerne ligeledes udledes.
En af de mest populære metoder til bestemmelse af proteinkoncentration er Bradford-assayet. I dette assay tilsættes et rødt farvestof kaldet coomassie brilliant blue til en proteinopløsning under sure betingelser. Da dette farvestof binder til protein, danner det et permanent blåt kompleks med en karakteristisk absorbans ved 595 nanometer.
På trods af Bradford-assayets generelle alsidighed er det uforeneligt med nogle proteinopløsninger. Bradford-assayet afbrydes især af tilstedeværelsen af natriumdodecylsulfat (SDS), et detergent, der almindeligvis bruges til at rense proteiner og nedbryde celler ved lysering. Dette detergent forstyrrer bindingen af farvestoffet til proteiner, hvilket resulterer i en upålidelig og unøjagtig absorptionsaflæsning. Andre typer metoder skal derefter bruges, når SDS er til stede.
En anden serie proteinassays er udviklet, og de involverer alle en variation af Biuret-testen. I denne reaktion kombineres et protein med en vandig base og kobber (II) -ioner. Disse ioner reduceres og cheleres derefter med protein til dannelse af farverige komplekser. To assays, der bruger denne test, er Lowry-assayet og bicinchoninsyreassayet.
Med Lowry-assayet tilsættes et Folin-Ciocalteu-reagens til Biuret-testen. Folin-Ciocalteu-reagenset oxiderer aromatiske rester, især tryptophan, og hjælper komplekset med at absorbere stærkt ved 750 nanometer. Bicinchoninsyreassayet på den anden side involverer tilsætning af bicinchoninsyre til Biuret-testen. Efter en kort inkubation ved ca. 104 ° Fahrenheit (40 ° Celsius) chelerer to ækvivalenter syre og peptidbindingerne af proteinet en enkelt kobber (I) ion. Resultatet er et kompleks, der absorberes stærkt ved 562 nanometer.
Når man vælger en metode til bestemmelse af proteinkoncentration, er det vigtigt for en at overveje de forskellige kemiske funktionelle grupper, der findes i opløsningen. Tilstedeværelsen af visse aminosyresidekæder, disulfidbindinger og cofaktorer kan gøre proteinkoncentrationsbestemmelsen vildt unøjagtig. Det er ofte nødvendigt, at man ikke kun overvejer proteinerne, men også andre reagenser og puffere, såsom reduktionsmidler og detergenter. Den ideelle metode er kemisk kompatibel såvel som den er pålidelig, billig og enkel at installere.