Jaké jsou různé metody stanovení koncentrace proteinů?
Existují stovky různých metod stanovení koncentrace proteinu. Neuvěřitelná rozmanitost typů proteinových roztoků, které biochemici analyzují, je důvod, proč neexistuje žádná univerzální metoda, která by fungovala pro každý typ proteinového roztoku. Nejběžnějším proteinovým testem je Bradfordův test, Lowryho test a test s kyselinou bicinchoninovou. Přesto byly vyvinuty nesčetné variace podle potřeby, aby se obešly případné chemické nekompatibility mezi proteinovým roztokem a reagenty, které se používají v testu.
Obecně lze říci, že existují dvě hlavní kategorie testů pro stanovení koncentrace proteinu. V první skupině metod se k proteinovému roztoku přidá barevné nebo fluorescenční barvivo, které se specificky váže na protein. Navázané barvivo má jedinečnou absorpční vlnovou délku, která je úměrná množství proteinu. Použitím spektrometru je možné odhadnout koncentraci proteinu.
Druhá skupina testů zahrnuje přidání iontů mědi (II) k roztoku proteinu, kde jsou tyto ionty redukovány na ionty mědi (I). Tyto redukované ionty jsou pak schopny vytvořit barevné komplexy vazbou na proteiny. Měřením absorbance na jejich jedinečných vlnových délkách lze také odvodit koncentrace proteinu.
Jednou z nejpopulárnějších metod stanovení koncentrace proteinu je Bradfordův test. V tomto testu je červené barvivo zvané coomassie brilantní modrá přidáno do proteinového roztoku za kyselých podmínek. Protože se toto barvivo váže na protein, vytváří trvalý modrý komplex s charakteristickou absorbcí na 595 nanometrů.
Přes obecnou univerzálnost Bradfordova testu je nekompatibilní s některými proteinovými roztoky. Zejména Bradfordův test je narušen přítomností dodecylsulfátu sodného (SDS), detergentu, který se běžně používá k čištění proteinů a štěpení buněk lýzou. Tento detergent narušuje vazbu barviva na proteiny, což má za následek nespolehlivé a nepřesné čtení absorpce. Je-li přítomen SDS, musí být použity jiné typy metod.
Byla vyvinuta další řada proteinových testů a všechny zahrnují variantu testu Biuret. V této reakci je protein kombinován s vodnou bází a ionty mědi (II). Tyto ionty jsou redukovány a poté chelátovány proteinem za vzniku barevných komplexů. Dva testy, které používají tento test, jsou Lowryho test a test bicinchoninové kyseliny.
Pomocí testu Lowry se do testu Biuret přidá činidlo Folin-Ciocalteu. Folin-Ciocalteuovo činidlo oxiduje aromatické zbytky, zejména tryptofan, a pomáhá komplexu absorbovat silně na 750 nanometrů. Na druhé straně stanovení kyseliny bicinchoninové zahrnuje přidání kyseliny bicinchoninové do testu Biuret. Po krátké inkubaci při asi 40 ° C (40 ° C) chelatují dva ekvivalenty kyseliny a peptidové vazby proteinu jediný iont mědi (I). Výsledkem je komplex, který se silně absorbuje při 562 nanometrech.
Při výběru metody pro stanovení koncentrace proteinu je důležité vzít v úvahu různé chemické funkční skupiny přítomné v roztoku. Přítomnost určitých postranních řetězců aminokyselin, disulfidových vazeb a kofaktorů může způsobit, že stanovení koncentrace proteinu bude nepřesné. Často je nutné vzít v úvahu nejen proteiny, ale také další činidla a pufry, jako jsou redukční činidla a detergenty. Ideální metoda bude chemicky kompatibilní, spolehlivá, levná a snadno nastavitelná.