Jaké jsou různé metody stanovení koncentrace proteinu?
Existují stovky různých metod stanovení koncentrace proteinu. Neuvěřitelná rozmanitost v typech proteinových roztoků, které biochemici analyzují, je důvod, proč neexistuje jediná univerzální metoda, která by fungovala pro každý typ proteinového roztoku. Nejběžnějšími proteinovými testy jsou test Bradford, test Lowry a test kyseliny bicinchoninové. Nicméně nesčetné variace byly vyvinuty podle potřeby pro řešení jakýchkoli potenciálních chemických nekompatibility mezi proteinovým roztokem a činidly, která se používají v testu.
Obecně řečeno, existují dvě hlavní kategorie stanovení koncentrace proteinu. V první skupině metod se do proteinového roztoku přidá barevné nebo fluorescenční barvivo a váže se konkrétně na protein. Vázané barvivo má jedinečnou absorpční vlnovou délku, která je úměrná množství proteinu. Použitím spektrometru je možné odhadnout koncentraci proteinu.
DruhýSkupina testů zahrnuje přidání iontů mědi (II) do roztoku proteinu, kde jsou tyto ionty redukovány na ionty mědi (I). Tyto snížené ionty jsou pak schopny tvořit barevné komplexy vazbou na proteiny. Měřením absorbancí na jejich jedinečných vlnových délkách lze také odvodit koncentrace proteinů.
Jednou z nejpopulárnějších metod stanovení koncentrace proteinu je Bradfordský test. V tomto testu se do proteinového roztoku za kyselých podmínek přidá červené barvivo zvané Coomassie brilantní modrá. Protože se toto barvivo váže na protein, tvoří permanentní modrý komplex s charakteristickou absorbance na 595 nanometrech.
Navzdory obecné všestrannosti testu Bradfordu je nekompatibilní s některými proteinovými roztoky. Zejména Bradfordský test je narušen přítomností dodecylsulfátu sodného (SDS), detergentu, který se běžně používá k čištění proteinů a BREak dolů buňky lýzou. Tento detergent interferuje s vazbou barviva na proteiny, což má za následek nespolehlivý a nepřesné absorpční čtení. Při přítomnosti SDS je tedy třeba použít jiné typy metod.
Byla vyvinuta další série proteinových testů a všechny zahrnují variantu Biuretova testu. V této reakci je protein kombinován s vodnou bází a ionty mědi (II). Tyto ionty jsou redukovány a poté chelátovány proteinem za vzniku barevných komplexů. Dva testy, které používají tento test, jsou test Lowry a test kyseliny bicinchoninové.
Při testu Lowry se do testu Biuret přidá se činidlo Folin-Ciocalteu. Reagent Folin-Ciocalteu oxiduje aromatické zbytky, zejména tryptofan, a pomáhá komplexu silně absorbovat při 750 nanometrech. Na druhé straně test kyseliny bicinchoninové kyseliny zahrnuje přidání bicinchoninové kyseliny do testu Biuret. Po krátké inkubaci při asi 104 ° Fahrenheita (40 ° Celsia), dva ekvivalentyKyselina a peptidové vazby proteinu chelátu jediný měď (I) ion. Výsledkem je komplex, který silně absorbuje na 562 nanometrech.
Při výběru metody pro stanovení koncentrace proteinu je důležité, aby v roztoku zvážil různé chemické funkční skupiny přítomné. Přítomnost některých postranních řetězců aminokyselin, disulfidových vazeb a kofaktorů může způsobit, že stanovení koncentrace proteinu je divoce nepřesná. Často je nutné, aby člověk zvážil nejen proteiny, ale také jiné činidla a pufry, jako je redukční činidla a detergenty. Ideální metoda bude chemicky kompatibilní a bude spolehlivá, levná a jednoduchá nastavení.