Quali sono i diversi metodi di determinazione della concentrazione proteica?
Esistono centinaia di metodi diversi per la determinazione della concentrazione proteica. L'incredibile diversità dei tipi di soluzioni proteiche che i biochimici analizzano è il motivo per cui non esiste un unico metodo universale che funzioni per ogni tipo di soluzione proteica. I test proteici più comuni sono il test Bradford, il test Lowry e il test dell'acido bicinchoninico. Tuttavia, sono state sviluppate una miriade di variazioni necessarie per aggirare eventuali potenziali incompatibilità chimiche tra la soluzione proteica e i reagenti che vengono utilizzati nel test.
In generale, ci sono due principali categorie di saggi per la determinazione della concentrazione proteica. Nel primo gruppo di metodi, un colorante colorato o fluorescente viene aggiunto a una soluzione proteica e si lega specificamente alle proteine. Il colorante legato ha una lunghezza d'onda di assorbimento unica che è proporzionale alla quantità di proteine. Usando uno spettrometro, diventa possibile stimare la concentrazione di proteine.
Il secondo gruppo di saggi prevede l'aggiunta di ioni rame (II) a una soluzione di proteine, dove questi ioni sono ridotti a ioni rame (I). Questi ioni ridotti sono quindi in grado di formare complessi colorati legandosi alle proteine. Misurando le assorbanze alle loro lunghezze d'onda uniche, si possono anche inferire le concentrazioni proteiche.
Uno dei metodi più popolari di determinazione della concentrazione proteica è il saggio Bradford. In questo test, un colorante rosso chiamato blu brillante di coomassie viene aggiunto a una soluzione proteica in condizioni acide. Poiché questo colorante si lega alle proteine, forma un complesso blu permanente con un'assorbanza caratteristica a 595 nanometri.
Nonostante la versatilità generale del test Bradford, è incompatibile con alcune soluzioni proteiche. In particolare, il test Bradford è interrotto dalla presenza di dodecil solfato di sodio (SDS), un detergente che viene comunemente utilizzato per purificare le proteine e scomporre le cellule per lisi. Questo detergente interferisce con il legame del colorante alle proteine, il che si traduce in una lettura di assorbimento inaffidabile e imprecisa. Altri tipi di metodi, quindi, devono essere utilizzati quando è presente SDS.
È stata sviluppata un'altra serie di saggi proteici che comportano tutti una variazione del test del biureto. In questa reazione, una proteina viene combinata con una base acquosa e ioni rame (II). Questi ioni vengono ridotti e quindi chelati dalle proteine per formare complessi colorati. Due saggi che utilizzano questo test sono il test Lowry e il test dell'acido bicinchoninico.
Con il test Lowry, un reagente Folin-Ciocalteu viene aggiunto al test Biuret. Il reagente Folin-Ciocalteu ossida i residui aromatici, in particolare il triptofano, e aiuta il complesso ad assorbire fortemente a 750 nanometri. Il test dell'acido bicinchoninico, d'altra parte, prevede l'aggiunta di acido bicinchoninico al test Biuret. Dopo una breve incubazione a circa 104 ° Fahrenheit (40 ° Celsius), due equivalenti di acido e i legami peptidici della proteina chelano un singolo ione rame (I). Il risultato è un complesso che si assorbe fortemente a 562 nanometri.
Quando si seleziona un metodo per la determinazione della concentrazione proteica, è importante considerare i diversi gruppi funzionali chimici presenti nella soluzione. La presenza di determinate catene laterali di aminoacidi, legami disolfuro e cofattori può rendere la determinazione della concentrazione proteica selvaggiamente inaccurata. Spesso è necessario considerare non solo le proteine ma anche altri reagenti e tamponi, come agenti riducenti e detergenti. Il metodo ideale sarà chimicamente compatibile, nonché affidabile, economico e semplice da installare.