Was sind die verschiedenen Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration?
Es gibt Hunderte verschiedener Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration. Die unglaubliche Vielfalt der Arten von Proteinlösungen, die Biochemiker analysieren, ist der Grund, warum es keine einzige universelle Methode gibt, die für jede Art von Proteinlösung funktioniert. Die gebräuchlichsten Proteinassays sind der Bradford-Assay, der Lowry-Assay und der Bicinchoninsäure-Assay. Trotzdem wurden nach Bedarf unzählige Variationen entwickelt, um mögliche chemische Inkompatibilitäten zwischen der Proteinlösung und den Reagenzien, die im Assay verwendet werden, zu umgehen.
Generell gibt es zwei Hauptkategorien von Assays zur Bestimmung der Proteinkonzentration. In der ersten Gruppe von Methoden wird einer Proteinlösung ein bunter oder fluoreszierender Farbstoff zugesetzt, der spezifisch an Protein bindet. Der gebundene Farbstoff hat eine einzigartige Absorptionswellenlänge, die proportional zur Proteinmenge ist. Mit einem Spektrometer kann die Proteinkonzentration abgeschätzt werden.
Die zweite Gruppe von Tests beinhaltet die Zugabe von Kupfer (II) -Ionen zu einer Proteinlösung, wobei diese Ionen zu Kupfer (I) -Ionen reduziert werden. Diese reduzierten Ionen können dann durch Bindung an Proteine bunte Komplexe bilden. Durch Messung der Extinktionen bei ihren einzigartigen Wellenlängen können ebenfalls die Proteinkonzentrationen abgeleitet werden.
Eine der beliebtesten Methoden zur Bestimmung der Proteinkonzentration ist der Bradford-Assay. In diesem Assay wird ein roter Farbstoff, genannt Coomassie Brilliant Blue, unter sauren Bedingungen zu einer Proteinlösung gegeben. Da dieser Farbstoff an Protein bindet, bildet er einen permanenten blauen Komplex mit einer charakteristischen Absorption bei 595 Nanometern.
Trotz der allgemeinen Vielseitigkeit des Bradford-Assays ist er mit einigen Proteinlösungen nicht kompatibel. Insbesondere wird der Bradford-Assay durch das Vorhandensein von Natriumdodecylsulfat (SDS) gestört, einem Detergens, das üblicherweise zur Reinigung von Proteinen und zum Abbau von Zellen durch Lyse verwendet wird. Dieses Waschmittel stört die Bindung des Farbstoffs an Proteine, was zu einer unzuverlässigen und ungenauen Absorptionsmessung führt. Wenn SDS vorhanden ist, müssen daher andere Arten von Methoden verwendet werden.
Es wurde eine weitere Reihe von Proteinassays entwickelt, die alle eine Variation des Biuret-Tests beinhalten. Bei dieser Reaktion wird ein Protein mit einer wässrigen Base und Kupfer (II) -Ionen kombiniert. Diese Ionen werden reduziert und dann durch Protein chelatisiert, um bunte Komplexe zu bilden. Zwei Assays, die diesen Test verwenden, sind der Lowry-Assay und der Bicinchoninsäure-Assay.
Beim Lowry-Assay wird dem Biuret-Test ein Folin-Ciocalteu-Reagenz hinzugefügt. Das Folin-Ciocalteu-Reagenz oxidiert aromatische Rückstände, insbesondere Tryptophan, und unterstützt die starke Absorption des Komplexes bei 750 Nanometern. Der Bicinchoninsäure-Assay beinhaltet andererseits die Zugabe von Bicinchoninsäure zum Biuret-Test. Nach einer kurzen Inkubation bei etwa 104 ° Fahrenheit (40 ° Celsius) chelatisieren zwei Äquivalente Säure und die Peptidbindungen des Proteins ein einzelnes Kupfer (I) -Ion. Das Ergebnis ist ein Komplex, der bei 562 Nanometern stark absorbiert.
Bei der Auswahl einer Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration ist es wichtig, die verschiedenen in der Lösung vorhandenen chemischen funktionellen Gruppen zu berücksichtigen. Das Vorhandensein bestimmter Aminosäureseitenketten, Disulfidbindungen und Cofaktoren kann die Bestimmung der Proteinkonzentration extrem ungenau machen. Es ist oft notwendig, nicht nur die Proteine, sondern auch andere Reagenzien und Puffer wie Reduktionsmittel und Detergenzien zu berücksichtigen. Die ideale Methode ist chemisch verträglich sowie zuverlässig, kostengünstig und einfach einzurichten.