Wat is bisulfietsequencing?
Bisulfietsequencing is een methode waarbij verschillende DNA-gebieden worden geanalyseerd met behulp van methylatie. Methylatie is het proces van het toevoegen van een specifiek molecuul, een methylgroep, aan een nucleotide, in dit geval meestal een cytosine. Inactieve nucleotiden worden vaak gemethyleerd, dus deze methode kan voor verschillende doeleinden worden gebruikt, van het bepalen van actieve regio's van een genoom tot het identificeren van genrijke regio's. Bij bisulfietsequencing worden gemethyleerde cytosines niet beïnvloed door het sequencingproces, terwijl niet-gemethyleerde cytosines worden omgezet in uracil, een nucleotide dat gewoonlijk niet wordt aangetroffen in het genetische materiaal, deoxyribonucleïnezuur (DNA).
Deze methode is erg gevoelig voor veranderingen in methylatie, dus kleine veranderingen in binding kunnen onderzoekers specifieke informatie over bepaalde nucleotiden geven. Natriumbisulfiet zet cytosine om in uracil, maar de omzetting vindt plaats in een omgeving waar gemethyleerd cytosine deze verandering niet zal ondergaan. Wanneer de bisulfietsequentiebepaling voltooid is, is het oorspronkelijke DNA omgezet in een aanzienlijk ander molecuul. Cytosines zullen sterk uitgeput zijn of mogelijk afwezig zijn. Als in dit geconverteerde molecuul nog steeds een cytosine wordt gevonden, vertegenwoordigt het een natuurlijk gemethyleerd cytosine in het beschouwde genoom.
Zoals alle experimentele protocollen heeft nadelen van bisulfiet nadelen. Het belangrijkste nadeel is dat het een zeer hoge zoutconcentratie vereist om goed te kunnen werken. Het zout stimuleert het gloeien van enkelstrengs DNA in zijn meer natuurlijke dubbele helix, en het natriumbisulfiet kan niet altijd cytosines bereiken als ze deel uitmaken van dubbelstrengs DNA. Als de zoutconcentratie te hoog is, mag een aantal cytosines niet worden omgezet in uracil, wat resulteert in een valse identificatie van gemethyleerde cytosines in een genoom. Denatureringsmiddelen kunnen nodig zijn om het aantal fout-positieve identificaties te minimaliseren.
Grote hoeveelheden genomische gegevens zijn niet nodig voor bisulfietsequencing, dus de methode heeft een nuttige toepassing voor het analyseren van klinische monsters. De oorspronkelijke nucleïnezuurbron doet er niet toe, maar de bron moet DNA zijn. In theorie zou ribonucleïnezuur (RNA) kunnen worden gesequenced met behulp van deze methode, omdat het meeste RNA enkelstrengig is en niet zo vatbaar is voor valse positieven vanwege geblokkeerde nucleotiden. In de praktijk is bisulfietsequencing echter niet nuttig voor RNA, omdat RNA van nature uracil bevat. Zonder een soort externe markering of toevoeging aan het protocol zouden geconverteerde cytosines niet te onderscheiden zijn van natuurlijke uracil.
Bij elk type sequentiemethode zijn nauwkeurigheid en precisie essentieel. Gevoelige methoden zoals bisulfietsequencing bieden een betrouwbaar middel voor sequentie-analyse, die op zijn beurt genanalyse en identificatie van doelen voor geneesmiddelen en therapieën mogelijk maakt. Hoewel deze methode niet kan worden gebruikt bij levende mensen, kan het nog steeds een grote hulp zijn met slechts de kleinste weefselmonsters om mee te werken.