Hva er Bisulfite Sequencing?

Bisulfitesekvensering er en metode der forskjellige DNA-regioner blir analysert ved bruk av metylering. Metylering er prosessen med å tilsette et spesifikt molekyl, kalt en metylgruppe, til et nukleotid, i dette tilfellet vanligvis et cytosin. Inaktive nukleotider blir ofte metylert, så denne metoden kan brukes til en rekke formål, fra bestemmelse av aktive regioner i et genom til identifisering av genrike regioner. Ved bisulfitt-sekvensering påvirkes ikke metylerte cytosiner av sekvenseringsprosessen, mens ikke-metylerte cytosiner omdannes til uracil, et nukleotid som vanligvis ikke finnes i arvestoffet, deoxyribonucleic acid (DNA.)

Denne metoden er veldig følsom for endringer i metylering, så små endringer i binding kan gi forskere spesifikk informasjon om bestemte nukleotider. Sodiumbisulfitt konverterer cytosin til uracil, men omdannelsen skjer i et miljø der metylert cytosin ikke vil gjennomgå denne endringen. Når bisulfitesekvensering er fullført, har det originale DNAet blitt omdannet til et betydelig forskjellig molekyl. Cytosiner vil bli sterkt utarmet eller potensielt fraværende. Hvis det fremdeles finnes et cytosin i dette konverterte molekylet, representerer det et naturlig metylert cytosin i genomet som vurderes.

Som alle eksperimentelle protokoller har bisulfitesekvensering ulemper. Den viktigste ulempen er at det krever en veldig høy saltkonsentrasjon for å fungere ordentlig. Saltet oppfordrer til annealing av enkeltstrenget DNA i sin mer naturlige dobbelt helix, og natriumbisulfitt kan ikke alltid nå cytosiner når de er en del av dobbeltstrenget DNA. Hvis saltkonsentrasjonen er for høy, er det mulig at et antall cytosiner ikke blir omdannet til uracil, noe som resulterer i falsk identifikasjon av metylerte cytosiner i et genom. Denatureringsmidler kan være nødvendig for å minimere antall falske positive identifikasjoner.

Store mengder genomiske data er ikke nødvendige for bisulfitt-sekvensering, så metoden har en nyttig applikasjon som analyserer kliniske prøver. Den opprinnelige nukleinsyrekilden betyr ikke noe, men kilden må være DNA. I teorien kan ribonukleinsyre (RNA) bli sekvensert ved bruk av denne metoden, siden det meste av RNA er enkeltstrenget og ikke ville være så utsatt for falske positiver på grunn av blokkerte nukleotider. Når de blir praktisert, er bisulfitesekvensering imidlertid ikke nyttig for RNA, fordi RNA naturlig har uracil i seg. Uten en slags ekstern merking eller tillegg til protokollen, ville konverterte cytosiner være skillebare fra naturlig uracil.

Når du foretar noen form for sekvenseringsmetodikk, er nøyaktighet og presisjon avgjørende. Følsomme metoder som bisulfitesekvensering tilbyr et pålitelig middel til sekvensanalyse, som igjen muliggjør genanalyse og identifisering av mål for medisiner og terapier. Selv om denne metoden ikke kan brukes på levende mennesker, kan den fortsatt være til stor hjelp med bare de minste vevsprøver du kan jobbe med.