Vad är Bisulfite Sequencing?

Bisulfit-sekvensering är en metod där olika regioner av DNA analyseras med metylering. Metylering är processen att lägga till en specifik molekyl, kallad en metylgrupp, till en nukleotid, i detta fall vanligtvis en cytosin. Inaktiva nukleotider metyleras ofta, så denna metod kan användas för en mängd olika ändamål, från att bestämma aktiva regioner i ett genom till att identifiera genrika regioner. Vid bisulfit-sekvensering påverkas metylerade cytosiner inte av sekvenseringsprocessen, medan icke-metylerade cytosiner omvandlas till uracil, en nukleotid som vanligtvis inte finns i det genetiska materialet, deoxyribonucleic acid (DNA.)

Denna metod är mycket känslig för förändringar i metylering, så små förändringar i bindning kan ge forskare specifik information om specifika nukleotider. Natriumbisulfit konverterar cytosin till uracil, men omvandlingen sker i en miljö där metylerad cytosin inte kommer att genomgå denna förändring. När bisulfit-sekvensering är klar har det ursprungliga DNA-värdet omvandlats till en signifikant annan molekyl. Cytosiner kommer att tappas kraftigt eller potentiellt frånvarande. Om en cytosin fortfarande finns i denna konverterade molekyl, representerar den ett naturligt metylerat cytosin i genomet som beaktas.

Liksom alla experimentella protokoll har bisulfit-sekvensering nackdelar. Dess viktigaste nackdel är att det kräver en mycket hög saltkoncentration för att fungera korrekt. Saltet uppmuntrar glödgning av enkelsträngat DNA till dess mer naturliga dubbla spiral, och natriumbisulfit kan inte alltid nå cytosiner när de ingår i dubbelsträngat DNA. Om saltkoncentrationen är för hög kan ett antal cytosiner kanske inte omvandlas till uracil, vilket resulterar i falsk identifiering av metylerade cytosiner i ett genom. Denatureringsmedel kan vara nödvändiga för att minimera antalet falska positiva identifieringar.

Stora mängder genomiska data är inte nödvändiga för bisulfit-sekvensering, så metoden har en användbar applikation som analyserar kliniska prover. Den ursprungliga nukleinsyrakällan spelar ingen roll, men källan måste vara DNA. I teorin kan ribonukleinsyra (RNA) sekvenseras med denna metod, eftersom de flesta RNA är enkelsträngade och inte skulle vara lika mottagliga för falska positiver på grund av blockerade nukleotider. När den implementeras är bisulfit-sekvensering emellertid inte användbar för RNA, eftersom RNA naturligtvis har uracil i sig. Utan någon form av extern märkning eller tillägg till protokollet skulle omvandlade cytosiner inte kunna skiljas från naturlig uracil.

När man utför någon typ av sekvenseringsmetod är noggrannhet och precision mycket viktiga. Känsliga metoder som bisulfit-sekvensering erbjuder ett pålitligt sätt för sekvensanalys, vilket i sin tur möjliggör genanalys och identifiering av mål för läkemedel och terapier. Även om denna metod inte kan användas på levande människor, kan den fortfarande vara till stor hjälp med bara de minsta vävnadsprover att arbeta med.