O que é o seqüenciamento de bissulfito?

O seqüenciamento de bissulfito é um método no qual diferentes regiões do DNA são analisadas usando metilação. A metilação é o processo de adição de uma molécula específica, chamada grupo metil, a um nucleotídeo, neste caso geralmente uma citosina. Os nucleotídeos inativos são frequentemente metilados, de modo que este método pode ser usado para uma variedade de propósitos, desde a determinação de regiões ativas de um genoma até a identificação de regiões ricas em genes. No seqüenciamento de bissulfito, as citosinas metiladas não são afetadas pelo processo de seqüenciamento, enquanto as citosinas não metiladas são convertidas em uracil, um nucleotídeo geralmente não encontrado no material genético, ácido desoxirribonucleico (DNA).

Esse método é muito sensível a alterações na metilação, portanto, pequenas alterações na ligação podem fornecer aos pesquisadores informações específicas sobre nucleotídeos específicos. O bissulfito de sódio converte a citosina em uracil, mas a conversão ocorre em um ambiente em que a citosina metilada não sofre essa alteração. Quando a sequência de bissulfito está completa, o DNA original foi convertido em uma molécula significativamente diferente. As citosinas ficarão muito esgotadas ou potencialmente ausentes. Se uma citosina ainda é encontrada nessa molécula convertida, ela representa uma citosina naturalmente metilada no genoma em consideração.

Como todos os protocolos experimentais, o seqüenciamento de bissulfito tem desvantagens. Sua desvantagem mais significativa é que requer uma concentração muito alta de sal para funcionar corretamente. O sal incentiva o recozimento do DNA de fita simples em sua hélice dupla mais natural, e o bissulfito de sódio nem sempre pode alcançar as citosinas quando fazem parte do DNA de fita dupla. Se a concentração de sal for muito alta, várias citosinas podem não ser convertidas em uracil, resultando na identificação falsa de citosinas metiladas dentro de um genoma. Podem ser necessários agentes desnaturantes para minimizar o número de identificações positivas positivas.

Grandes quantidades de dados genômicos não são necessárias para o seqüenciamento de bissulfito; portanto, o método possui uma aplicação útil na análise de amostras clínicas. A fonte original de ácido nucleico não importa, mas a fonte deve ser DNA. Em teoria, o ácido ribonucleico (RNA) poderia ser sequenciado usando esse método, uma vez que a maioria do RNA é de cadeia simples e não seria tão suscetível a falsos positivos por causa de nucleotídeos bloqueados. Quando colocado em prática, no entanto, o seqüenciamento de bissulfito não é útil para o RNA, porque o RNA naturalmente contém uracil. Sem algum tipo de marcação externa ou adição ao protocolo, as citosinas convertidas seriam indistinguíveis do uracil natural.

Ao empreender qualquer tipo de metodologia de seqüenciamento, a exatidão e a precisão são essenciais. Métodos sensíveis como o seqüenciamento de bissulfito oferecem um meio confiável de análise de sequência, o que, por sua vez, permite a análise de genes e a identificação de alvos para medicamentos e terapias. Embora esse método não possa ser usado em pessoas vivas, ainda pode ser de grande ajuda apenas com a menor das amostras de tecido para se trabalhar.