Co to jest sekwencjonowanie wodorosiarczynem?
Sekwencjonowanie wodorosiarczynem jest metodą, w której analizuje się różne regiony DNA za pomocą metylacji. Metylacja to proces dodawania konkretnej cząsteczki, zwanej grupą metylową, do nukleotydu, w tym przypadku zwykle cytozyny. Nieaktywne nukleotydy są często metylowane, więc tę metodę można wykorzystać do różnych celów, od określania aktywnych regionów genomu po identyfikację regionów bogatych w geny. W sekwencjonowaniu wodorosiarczynowym proces sekwencjonowania nie wpływa na metylowane cytozyny, podczas gdy niemetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, nukleotyd zwykle nie występujący w materiale genetycznym, kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA).
Ta metoda jest bardzo wrażliwa na zmiany w metylacji, więc niewielkie zmiany w wiązaniu mogą dostarczyć badaczom konkretnych informacji na temat poszczególnych nukleotydów. Wodorosiarczyn sodu przekształca cytozynę w uracyl, ale konwersja zachodzi w środowisku, w którym metylowana cytozyna nie ulegnie tej zmianie. Po zakończeniu sekwencjonowania wodorosiarczynu oryginalne DNA zostało przekształcone w istotnie inną cząsteczkę. Cytozyny zostaną znacznie zubożone lub potencjalnie nieobecne. Jeśli cytozyna nadal znajduje się w przekształconej cząsteczce, reprezentuje naturalnie metylowaną cytozynę w rozważanym genomie.
Podobnie jak wszystkie protokoły eksperymentalne, sekwencjonowanie wodorosiarczynów ma wady. Jego najważniejszą wadą jest to, że wymaga bardzo wysokiego stężenia soli, aby działać poprawnie. Sól zachęca do hybrydyzacji jednoniciowego DNA w bardziej naturalnej podwójnej helisie, a wodorosiarczyn sodu nie zawsze może dotrzeć do cytozyn, gdy są one częścią dwuniciowego DNA. Jeśli stężenie soli jest zbyt wysokie, pewna liczba cytozyn może nie zostać przekształcona w uracyl, co prowadzi do fałszywej identyfikacji metylowanych cytozyn w obrębie genomu. Czynniki denaturujące mogą być konieczne w celu zminimalizowania liczby fałszywie pozytywnych identyfikacji.
Duże ilości danych genomowych nie są konieczne do sekwencjonowania wodorosiarczynów, więc metoda ma przydatne zastosowanie do analizy próbek klinicznych. Oryginalne źródło kwasu nukleinowego nie ma znaczenia, ale źródłem musi być DNA. Teoretycznie kwas rybonukleinowy (RNA) można sekwencjonować przy użyciu tej metody, ponieważ większość RNA jest jednoniciowa i nie byłaby tak podatna na fałszywie dodatnie z powodu zablokowanych nukleotydów. Jednak w praktyce sekwencjonowanie wodorosiarczynem nie jest przydatne dla RNA, ponieważ RNA ma w nim naturalnie uracyl. Bez jakiegoś zewnętrznego oznakowania lub dodatku do protokołu przekształcone cytozyny byłyby nie do odróżnienia od naturalnego uracylu.
Przy podejmowaniu dowolnej metodologii sekwencjonowania niezbędna jest dokładność i precyzja. Wrażliwe metody, takie jak sekwencjonowanie wodorosiarczynów, oferują wiarygodne środki analizy sekwencji, co z kolei pozwala na analizę genów i identyfikację celów dla leków i terapii. Chociaż tej metody nie można zastosować u żywych ludzi, może ona być bardzo pomocna przy pracy z najmniejszymi próbkami tkanek.