Was ist Bisulfit-Sequenzierung?
Die Bisulfitsequenzierung ist eine Methode, bei der verschiedene DNA-Regionen unter Verwendung von Methylierung analysiert werden. Methylierung ist der Vorgang, bei dem einem Nukleotid ein spezifisches Molekül, eine sogenannte Methylgruppe, hinzugefügt wird, in diesem Fall normalerweise ein Cytosin. Inaktive Nukleotide werden häufig methyliert, so dass dieses Verfahren für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden kann, von der Bestimmung aktiver Regionen eines Genoms bis zur Identifizierung genreicher Regionen. Bei der Bisulfitsequenzierung werden methylierte Cytosine nicht durch den Sequenzierungsprozess beeinflusst, während nicht methylierte Cytosine in Uracil umgewandelt werden, ein Nukleotid, das normalerweise nicht im genetischen Material enthalten ist, nämlich Desoxyribonukleinsäure (DNA).
Diese Methode reagiert sehr empfindlich auf Änderungen der Methylierung. Daher können kleine Änderungen der Bindung den Forschern spezifische Informationen über bestimmte Nukleotide liefern. Natriumbisulfit wandelt Cytosin in Uracil um, aber die Umwandlung erfolgt in einer Umgebung, in der methyliertes Cytosin diese Änderung nicht erfährt. Nach Abschluss der Bisulfit-Sequenzierung wurde die ursprüngliche DNA in ein deutlich anderes Molekül umgewandelt. Cytosine werden stark erschöpft sein oder möglicherweise fehlen. Befindet sich in diesem umgesetzten Molekül noch ein Cytosin, so handelt es sich im betrachteten Genom um ein natürlich methyliertes Cytosin.
Wie alle experimentellen Protokolle hat die Bisulfit-Sequenzierung Nachteile. Sein größter Nachteil ist, dass es eine sehr hohe Salzkonzentration erfordert, um richtig zu arbeiten. Das Salz fördert das Annealing von einzelsträngiger DNA in ihre natürlichere Doppelhelix, und das Natriumbisulfit kann Cytosine nicht immer erreichen, wenn sie Teil von doppelsträngiger DNA sind. Wenn die Salzkonzentration zu hoch ist, wird möglicherweise eine Reihe von Cytosinen nicht in Uracil umgewandelt, was zu einer falschen Identifizierung von methylierten Cytosinen innerhalb eines Genoms führt. Denaturierungsmittel können erforderlich sein, um die Anzahl falsch positiver Identifikationen zu minimieren.
Große Mengen genomischer Daten sind für die Bisulfit-Sequenzierung nicht erforderlich, sodass das Verfahren eine nützliche Anwendung für die Analyse klinischer Proben bietet. Die ursprüngliche Nukleinsäurequelle spielt keine Rolle, aber die Quelle muss DNA sein. Theoretisch könnte Ribonukleinsäure (RNA) mit dieser Methode sequenziert werden, da die meisten RNAs einzelsträngig sind und aufgrund blockierter Nukleotide nicht so anfällig für falsch positive Ergebnisse sind. In der Praxis ist die Bisulfit-Sequenzierung für RNA jedoch nicht sinnvoll, da RNA von Natur aus Uracil enthält. Ohne irgendeine äußere Markierung oder Ergänzung des Protokolls wären umgewandelte Cytosine nicht von natürlichem Uracil zu unterscheiden.
Bei der Durchführung von Sequenzierungsmethoden jeglicher Art sind Genauigkeit und Präzision von entscheidender Bedeutung. Sensitive Methoden wie die Bisulfit-Sequenzierung bieten ein zuverlässiges Mittel zur Sequenzanalyse, das wiederum die Genanalyse und Identifizierung von Targets für Medikamente und Therapien ermöglicht. Obwohl diese Methode bei lebenden Menschen nicht angewendet werden kann, kann sie nur bei den kleinsten Gewebeproben, mit denen gearbeitet werden soll, eine große Hilfe sein.