Co je bisulfitové sekvenování?
Bisulfitové sekvenování je metoda, ve které jsou různé oblasti DNA analyzovány pomocí methylace. Methylace je proces přidání specifické molekuly, nazývané methylová skupina, k nukleotidu, v tomto případě obvykle cytosinu. Neaktivní nukleotidy jsou často methylovány, takže tento způsob může být použit pro různé účely, od stanovení aktivních oblastí genomu po identifikaci oblastí bohatých na gen. Při bisulfitovém sekvenování nejsou methylované cytosiny ovlivněny procesem sekvenování, zatímco nemetylované cytosiny jsou přeměněny na uracil, nukleotid, který se obvykle nenachází v genetickém materiálu, kyselina deoxyribonukleová (DNA).
Tato metoda je velmi citlivá na změny v methylaci, takže malé změny ve vazbě mohou vědcům poskytnout konkrétní informace o konkrétních nukleotidech. Bisulfit sodný převádí cytosin na uracil, ale ke konverzi dochází v prostředí, ve kterém methylovaný cytosin tuto změnu nepodstoupí. Když je bisulfitové sekvenování kompletní, původní DNA byla přeměněna na výrazně odlišnou molekulu. Cytosiny budou velmi vyčerpané nebo potenciálně chybí. Pokud se v této přeměněné molekule stále nachází cytosin, představuje v uvažovaném genomu přirozeně methylovaný cytosin.
Stejně jako všechny experimentální protokoly má bisulfitové sekvenování nevýhody. Jeho nejvýznamnější nevýhodou je, že pro správnou funkci vyžaduje velmi vysokou koncentraci soli. Sůl podporuje žíhání jednovláknové DNA do její přirozenější dvoušroubovice a hydrogensiřičitan sodný nemůže vždy dosáhnout cytosinů, když jsou součástí dvouvláknové DNA. Pokud je koncentrace soli příliš vysoká, nemusí být množství cytosinů přeměněno na uracil, což vede k falešné identifikaci methylovaných cytosinů v genomu. Denaturační látky mohou být nezbytné k minimalizaci počtu falešně pozitivních identifikací.
Velké množství genomických dat není nutné pro bisulfitové sekvenování, takže metoda má užitečnou aplikaci pro analýzu klinických vzorků. Na původním zdroji nukleové kyseliny nezáleží, ale zdrojem musí být DNA. Teoreticky by mohla být ribonukleová kyselina (RNA) sekvenována pomocí této metody, protože většina RNA je jednovláknová a nebyla by tak citlivá na falešně pozitivní, protože blokované nukleotidy. Po zavedení do praxe však není bisulfitové sekvenování pro RNA užitečné, protože RNA v něm přirozeně obsahuje uracil. Bez jakéhokoli vnějšího značení nebo přidání do protokolu by byly přeměněné cytosiny nerozeznatelné od přirozeného uracilu.
Při provádění jakéhokoli typu metodiky sekvenování je nezbytná přesnost a přesnost. Citlivé metody, jako je bisulfitové sekvenování, nabízejí spolehlivé prostředky pro sekvenční analýzu, která zase umožňuje genovou analýzu a identifikaci cílů pro léky a terapie. Ačkoli tuto metodu nelze použít u žijících lidí, stále může velmi pomoci pouze s nejmenšími vzorky tkáně, se kterými lze pracovat.